转VEGF和转Tβ4基因陕北白绒山羊粪便中菌群分析

李陇平 白彩霞 朱海鲸

摘要：以转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊与野生型陕北白绒山羊为研究对象，采集其新鲜粪便样品，用灭菌生理盐水进行梯度稀释后，分别接种LB固体培养基、TPY琼脂、胆硫乳琼脂、肠球菌琼脂、伊红美蓝琼脂和甘露醇盐琼脂培养基，37 ℃恒温过夜培养，再分别对平板上生长的所有需氧菌、双歧杆菌、沙门氏菌、肠球菌、大肠菌群和金黄色葡萄球菌进行菌落计数，并做显著性检验分析。结果表明，转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊与野生型陕北白绒山羊粪便中的需氧菌菌群结构之间不存在显著性差异。研究结果为转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊安全性评价研究提供了试验数据和研究基础。

关键词：VEGF基因;Tβ4基因;转基因陕北白绒山羊;粪便菌群结构;生物安全

中图分类号： S852.6  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）02-0162-03

与动物育种的常规方法相比，转基因技术具有加速育种进程、缩短育种年限、增强种畜性状稳定性、提高育种效率等优点。目前，广泛地应用于新品种培育和动物品种改良方面。但是，转基因技术从开始到现在一直受到很多争议，转基因动物的安全性受到人们的质疑，而且其涉及面广、影响深远。因此，开展对转基因动物安全性评估方面的研究就显得至关重要[1-2]。陕北白绒山羊是经过国家审定的一个绒肉兼用型的绒山羊新品种，在榆林和延安以及陕西等陕北周边地区大量饲养，在地方经济发展和农牧民增收方面起着非常重要的作用。绒山羊的绒和毛分别是由其皮肤的次级毛囊和初级毛囊生成，特别是绒的价格斐然，素有“软黄金”之誉。毛囊具有高度自我更新能力，它的1个重要特征就是周期性生长，一般经历生长期、退行期和休止期3个阶段。毛囊的周期性生长和发育是多基因参与、紧密联系且相互制约的复杂生理生化过程，需要多种生长信号的精细调控。毛囊的周期性更新生长和血管的新生密切相关，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管新生和退化的变化过程中发挥着重要的调控作用，具有促进血管形成[3]，从而促进毛囊发育[4-5]，并且研究证实VEGF在毛囊生长期表达量最高[6]。胸腺素β4（Tβ4）属于胸腺素（thymosins）β家族，是重要的一类淋巴细胞因子，作用于毛囊干细胞并激活其分化和迁移，还可以通过促进基质金属蛋白酶的合成分泌影响毛囊发育生长[7]。在国家转基因重大专项的支持下，2015年笔者所在实验室利用PiggyBac转座子介导转VEGF和Tβ4基因并制备绒山羊胎儿成纤维细胞，最终通过核移植方法分别获得了转VEGF基因陕北白绒山羊2只（F0代，公羊、母羊各1只）和转Tβ4基因陕北白绒山羊5只（F0代，公羊4只、母羊1只）。随后，通过本交又获得了转VEGF基因阳性陕北白绒山羊F1代4只（公羊1只、母羊3只）和转Tβ4基因阳性陕北白绒山羊F1代2只（全部为公羊）。这些转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊的产绒量明显高于野生型绒山羊，为绒山羊新品种的培育提供了新的育种材料。

为保障人类健康和生态安全、促进生物技术的可持续发展，我国对于转基因动物的研究、开发和审批过程严格遵守法制化管理，并制定了一系列法律法规。其中，转基因动物自身健康和福利、环境安全、人类健康和食品安全是对转基因动物生物安全评价研究关注的核心问题。对于转基因动物的自身安全性，除了须要关注转基因动物生长、发育、生理活动、主要器官等各个方面，对于转基因动物的胃肠道微生物菌群结构变化也是重点研究的方面。越来越多的研究发现，胃肠道微生态平衡对于维持动物良好的生理代谢、疾病预防、免疫和营养代谢等诸多方面都起着重要作用[8-10]。然而，目前关于转基因动物胃肠道微生物区系变化的研究鲜见报道，只见对转sFat-1基因猪的胃肠道及粪便样品中微生物菌群变化研究的报道[11]。本试验通过分析转VEGF基因和转Tβ4基因及野生型陕北白绒山羊F1、F0代粪便在LB固体培养基及TPY琼脂、胆硫乳琼脂、肠球菌琼脂、伊红美蓝琼脂和甘露醇盐琼脂不同培养基中的细菌菌落生长情况并计数，通过统计分析讨论转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊粪便中微生物是否存在显著性差异，为转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊生物安全评价研究提供试验数据和研究基础。

1 材料与方法

试验于2016年7—12月，在陕西省陕北绒山羊工程技术研究中心进行。

1.1 试验动物

榆林学院西区试验羊场转VEGF基因陕北白绒山羊F0代公羊和母羊各1只，转Tβ4基因陕北白绒山羊F0代公羊3只、母羊1只;转VEGF基因陕北白绒山羊F1代公羊1只、母羊3只，转Tβ4基因陕北白绒山羊F1代公羊2只;野生型陕北白绒山羊公羊、母羊各3只。

1.2 试验试剂

TPY琼脂（HB0397）、EMB伊紅美蓝琼脂（HB0107）、BEA肠球菌琼脂（HB0133）、DHL胆硫乳琼脂（HB4087）和MSA甘露醇盐琼脂（HB4128-2），购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集与预处理 选取健康、体况良好的转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊和野生陕北白绒山羊F0与F1的新鲜粪样样品，做好标记，低温保存，立即送回实验室进行后续试验。

1.3.2 微生物培养与计数 分别称取1 g粪便样品，加入到装有9 mL灭菌水的离心管，并做好标记，轻轻振荡混合均匀之后并对其进行梯度稀释。选择2～3个合适的稀释度，注入已做好标记的灭菌培养皿中，然后迅速倒入20 mL灭菌后平衡至50 ℃的不同类型的琼脂培养基，轻轻转动培养皿使其中的培养基与菌液混合均匀，待培养基凝固（每个稀释度做3个，过程中注意无菌操作）后，37 ℃恒温倒置培养48 h，观察在不同琼脂培养基上生长的菌落形态并计数。

1.3.3 菌落计数 菌落计数方法：肉眼观察菌落并计数。试验结果报告方法如下：（1）首先选取各稀释度的平均菌落数在30～300个之间的平板，当只有1个稀释度的平均菌落数在30～300个之间时，以其稀释倍数乘以其菌落数报告。（2）当其中有2个稀释度的平均菌落数都在30～300个之间，就按照这2个稀释度的菌落总数的比值来判定（当比值<2时，报告这2个平均菌落数的平均值;当比值>2时，报告这2个平均菌落数当中比较小的菌落总数）。（3）当每个稀释度的平均菌落数都>300个时，按照稀释倍数乘以其中稀释度最高的平均菌落数来报告。（4）当每个稀释度的平均菌落数都<30个时，按照稀释倍数乘以其中稀释度最低的平均菌落数来报告。（5）当每个稀释度的平均菌落数都不在 30～300个时，应按照其中最接近30个或300个的平均菌落数乘以其稀释倍数来报告。（6）当报告的菌落数在100个以内时，应按照其实际数据报告;>100个时，采用2位有效数字来表示;在2位有效数字后面的数值，按照四舍五入的方法计算。

1.4 统计分析

试验数据用“平均值±标准差”形式来表示。采用t检验对试验结果进行显著性分析：P<0.05，差异显著;P>0.05，差异不显著。

2 结果与分析

2.1 菌落形态特征

转基因与野生型陕北白绒山羊的粪便样品在不同选择性培养基上的菌落生长情况见图1。

2.2 粪样中需氧微生物菌落

转VEGF基因与转Tβ4基因陕北白绒山羊和野生型陕北白绒山羊F0代、F1代公羊和母羊粪便中所有需氧菌、双歧杆菌、肠球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠菌群的试验数据见表1至表4。t检验结果表明，转FGF5s基因与转Tβ4基因陕北白绒山羊和野生型陕北白绒山羊粪便微生物菌群之间没有显著性差异。

3 讨论

细菌菌群通过排泄物从转VEGF基因和转Tβ4基因绒山羊释放到环境中，因此，粪便是用来研究转基因绒山羊体内各种微生物变化和转基因动物自身健康状况的有效载体，能够准确反映肠道微生物的变化情况，同时也避免了在转VEGF基因和转Tβ4基因数量不多的情况下对其进行宰杀。肠道内微生物菌群平衡是动物机体健康状态的重要标志，越来越多的研究发现，胃肠道微生态平衡对于维持动物良好的生理代谢、疾病预防、免疫和营养代谢等诸多方面都起着重要作用[8-10]。当转入外源VEGF和Tβ4基因后，在增加绒山羊绒毛品质和产量的同时，绒山羊胃肠道菌群的种类、数量和比例可能会受到一定程度的影响。所以，转VEGF基因和转Tβ4基因绒山羊安全性评价研究中，有必要对粪便中微生物菌群结构及其变化进行分析。本试验选用6种不同培养基分别对转VEGF基因和转Tβ4基因绒山羊和野生型陕北白绒山羊粪便中微生物进行培养、计数及统计分析，在以小鼠为模型研究转基因小鼠安全性的试验中，也是以這6种指示菌作为目标菌进行分析[12-13]。在这些微生物中，大肠菌群和沙门氏菌与动物的生理代谢相关，而双歧杆菌、大肠杆菌群和肠球菌是动物消化道中的主要优势菌群[14]。所以，研究这些菌群在转VEGF基因和转Tβ4基因绒山羊体内的变化是非常有意义的。

研究结果表明，F0代和F1代转VEGF基因和转Tβ4基因绒山羊与野生型陕北白绒山羊粪便中细菌菌群的组成和结构没有显著性差异（P>0.05），主要有益菌和有害菌的组成和菌群结构与对照组相比都没有发生变化。这些研究结果与对转PEPCK-1基因猪[15]和转eGFP基因小鼠[16]的生物安全评价的研究结果一致。笔者的研究工作不仅积累了对转VEGF基因和转Tβ4基因绒山羊安全性评价研究的数据，而且也为其他转基因动物的安全性评价研究提供了思路。

4 结论

本试验使用LB固体培养基及TPY琼脂、胆硫乳琼脂、肠球菌琼脂、伊红美蓝琼脂和甘露醇盐琼脂培养基，对转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊及野生型陕北白绒山羊F0及F1代粪样分别进行培养、计数、统计分析，结果表明两者并无显著性差异（P>0.05），说明转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊粪便中需氧微生物与野生型陕北白绒山羊不存在显著性差异，研究结果为转基因陕北白绒山羊的安全性评价研究提供了试验数据和研究基础。

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