基于SSR标记的同一花序贵州野生白三叶遗传多样性分析

李莉 吴永洁 王元素

摘要：采用简单重复序列（SSR）分子标记技术，对19份分别来源于同一花序的贵州野生白三叶样品进行遗传多样性及亲缘关系研究。结果表明，利用20对引物共扩增出207个条带，其中178个条带具有多态性。20对引物多态性位点的比例为76.92%～92.31%，平均多态性为85.99%。20对引物对19份白三叶材料SSR的PCR扩增条带的多态信息含量为 0.380 6～0.499 7，平均为0.463 2。在相似系数为0.60时，把19份白三叶材料划分为3大类。第1类是W18，最早被分开独立成一类，从SSR标记来看，W18与其余材料的亲缘关系较远。第2类包括W2和W13，表明这2个居群间亲缘关系较近，遗传差异不大。第3类为剩下的16个品种，居群间的遗传关系较复杂。

关键词：贵州;野生白三叶;同一花序;遗传多样性;SSR

中图分类号： S541+.903.2  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）02-0049-05

植物在进化过程中，形成了适应外界环境变化的功能性状[1]，但研究表明，植物遗传背景是植物功能性状变异的主要来源之一，甚至大于环境因素的影响[2]。张莉等研究也提出研究植物性状对环境变化的响应，必须明确遗传背景与环境对植物性状的相对影响，以排除遗传背景的作用[3]。

在植物不同花或花序之间存在不同程度的繁殖资源分配和竞争问题，即植株不同部位的花甚至是同一个花序内不同部位花的地位是不平等的，存在明显的位置效应[4]，导致同株植物甚至同一花序不同位置的小花、果实和种子的数量、大小、形态及繁殖效率可能存在差异[5]。张鹤山等研究表明，不同取样地红三叶的单株花序数和单个花序小花数的变异是体现多样性的重要指标[6]。刘左军等统计不同部位头状花序的生物量投入，并分析了存在于总状花序内资源分配上的结构效应及其对不同生境条件的反应[4]。

白三叶是多年生优质豆科牧草，为异花授粉植物，广泛分布于世界各地，在畜牧业发展中起重要作用。吴永洁等采用温室大棚培养，用来源于同一花序的白三叶作为试验材料，研究贵州野生白三叶的形态多样性，以排除环境因素对试验的影响，在同一花序水平上研究形态多样性，可以减少基因漂移和花粉污染等因素的影响，为进一步研究其遗传水平上的多样性提供基础数据[7]。目前简单重复序列（SSR）已被广泛应用于各种研究，如遗传多样性分析[8]、种质分子身份证的构建[9]、遗传连锁图绘制及QTL定位[10]、目标性状基因定位和分子标记辅助育种[11]等。本研究以贵州省境内19份野生白三叶种质为研究对象，比较同一花序水平上的遗传多样性，可为下一步选育优质高效白三叶新品种提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集 2013年5—8月在贵州省范围内收集野生白三叶种子，共收集19份种质，具体收集地点见表1。

1.1.2 温室栽培 于2014年9月20日在贵州省牧草种子检测中心温室大棚内播种。参照吴永洁等的方法[7]，从19份材料中各选取1个果实饱满的花序，将来自同一花序的种子播入有32个小格的育苗盘中，每小格播2粒种子，3个月成苗期后，在形态多样性研究的基础上，选择形态上有代表性的幼苗进行SSR标记试验。

1.1.3 试验试剂 DNA提取试剂盒（购自大连宝生物公司）;26对SSR引物（由大连宝生物公司合成）。

1.2 白三叶总DNA提取

取野生白三叶新生叶片，提取总DNA。用0.75%琼脂糖凝胶电泳检测其质量。

1.3 SSR-PCR扩增体系与程序

参考牟彤等的白三叶SSR分析体系[12-13]，通过单因素梯度组合试验，得到优化后最优的白三叶20 μL反应体系：模板20 ng，10×PCR Bufer 2 μL，Mg2+（25 mmol/L）2.4 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL） 0.1 μL，上、下游引物均为0.6 μL（0.1 mmol/μL），用灭菌水补足20 μL，覆盖矿物油。

1.4 引物筛选

参照Zietkiewicz等的研究[14-15]，挑选出多样性较高的26对SSR引物，并将其交由大连宝生物公司合成。从供试材料中选出质量较高且形态性状差异较大的W11及W12材料对26对引物进行剔选，最终选出20对多态性好、稳定性高、条带清晰的引物对全部材料进行PCR扩增，引物序列见表2。

1.5 数据处理

对凝胶电泳后获得清晰稳定的DNA扩增条带进行统计，在相同迁移位置上的谱带，有带的赋值为“1”，无带的赋值为“0”，建立遗传相似矩阵。通过该矩阵，统计SSR-PCR扩增产物总条带数和具有多态性的条带数，用Excel计算多态性位点百分率PPB（PPB=NPB/TNB×100%，其中TNB指 SSR-PCR 扩增的总条带数，NPB指具有多态性的条带数[16]）、标记指数MI（MI=NPB×PIC）[17]、引物多态性信息含量PIC[PIC=2fi（1-fi），其中fi表示有带的所占的频率]。用NTSYS-PC 2.02软件计算Dice遗传距离GD[GD=1-2Nij/（Ni+Nj），其中Ni指材料i中出现的扩增片段数，Nj指材料j中出现的扩增片段数，Nij指材料i和j共有的扩增片段数]，用以估计各白三叶种质间的遗传多样性[16，18]。根据非加权组平均法（UPGMA）法进行遗传相似性聚类分析[19]。

2 結果与分析

2.1 贵州野生白三叶同一花序DNA纯度检测

采用0.75%琼脂糖凝胶电泳对提取的19份野生白三叶DNA进行检测，结果见图1（图中1～19对应19份材料），可见DNA的完整性较好，纯度较高。