黄瓜PP2-A1蛋白的生物信息学分析

庞宁宁 樊怀福 王哲

摘要：韧皮部蛋白2（PP2）是植物特异性的韧皮部蛋白，通过参与植物调控其细胞内基因表达水平和产物活性来应对自然界中的各种胁迫，对于维持植物株体形态、体内物质运转和保护愈合植物伤口有重要意义。以前期克隆得到的黄瓜（Cucumis sativus）PP2-A1蛋白序列为对象，利用生物信息学方法，对黄瓜PP2-A1蛋白序列进行生物学功能分析。结果表明，黄瓜PP2-A1蛋白具有亲水性，比较不稳定，半衰期短，无信号肽段，没有跨膜结构，是定位在胞质的非分泌蛋白;结合对其二级结构和三级结构的预测分析，得出PP2-A1是以无规则卷曲和延伸链为主的片层结构;构建PP2的系统发育树，发现其与香瓜亲缘关系最近，同时预测其结构功能域，发现其具有1个典型的PP2结构功能域。

关键词：黄瓜;PP2-A1蛋白;分子生物信息学;亲水性;系统发育树

中图分类号： S642.201  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）02-0046-03

韧皮部蛋白（phloem protein，PP）是从植物韧皮部汁液中提取出来的能特异性结合几丁质的一种凝集素[1-2]，植物韧皮部蛋白是通过调控植物细胞内基因表达水平和产物活性来应对自然界中的各种胁迫参与到植物生命活动中，对于维持植物株体形态、内体物质的运转和愈合植物伤口有着重要意义[3]。韧皮部蛋白2（PP2）是韧皮部汁液中最丰富、最神秘的蛋白质之一，韧皮部蛋白基因2在植物界的广泛分布也表明它们在维管植物中是古老的、常见的[4]，它是一种二聚体几丁质结合凝集素，能够在同化物流中起转运的作用，并且其中的凝集素活性或RNA结合特性可以在长距离上发挥功能[5-6]。由于筛管不能转录和翻译，韧皮部蛋白质最可能在紧密连接的伴侣细胞中合成，并通过胞间连丝转运到筛分元件中[7]。韧皮部液体的特异性蛋白质组成表明，这些蛋白质不仅对筛管维持，而且对于整个植物的生理和发育也起了重要的作用[8]。任何不同植物物种的蛋白质都可从成熟筛管的汁液中分离出来，但是迄今为止，仅有少数已确定其功能特征[9]。

Lee等使用FPLC凝胶过滤柱从热处理的拟南芥幼苗的蛋白质提取物中提取了几种韧皮部汁液蛋白，发现它们从功能上表征了PP2-A1基因，其编码氨基酸也类似于韧皮部凝集素的蛋白质，利用细菌表达的AtPP2-A1重组蛋白，发现其具有双重功能，即分子伴侣活性和抗真菌活性。在拟南芥防御系统中起着关键作用，能够对抗各种外部胁迫，包括真菌病原侵袭和热休克[10]。前期通过iTRAQ蛋白组学的方法研究了盐胁迫对于黄瓜韧皮部渗出液蛋白质组的影响，发现在盐胁迫条件下，黄瓜PP2-A1蛋白的表达量显著上调，推测这可能是黄瓜韧皮部适应逆境胁迫的一种响应机制[11]。本研究通过分子生物信息学的方法，研究黄瓜PP2-A1蛋白序列的进化情况，并对黄瓜PP2-A1蛋白的理化特性、跨膜结构、信号肽、亚细胞定位情况和二、三级结构等进行分析，旨在了解黄瓜PP2-A1蛋白的基本特性，并预测它的功能，为进一步揭示PP2-A1基因的防御功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以前期克隆得到的黃瓜（Cucumis sativus）PP2-A1蛋白序列为对象，利用生物信息学方法，对黄瓜PP2-A1蛋白序列进行生物学功能分析。

1.2 方法

1.2.1 理化性质分析及疏水性结构预测 应用ExPAsY Protparam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）在线分析工具对黄瓜PP2-A1蛋白分子量（MW）、等电点（pI）等进行预测分析;利用在线软件ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）预测黄瓜PP2-A1蛋白的疏水性结构。

1.2.2 亚细胞定位、信号肽以及跨膜结构预测 利用Signal IP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/performance.php）对黄瓜PP2-A1蛋白N-末端信号肽进行预测分析，利用SubLoc V1.0（https：//omictools.com/subloc-tool）对PP2-A1蛋白分析亚细胞定位情况;利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.biomedsearch.com/sci/TMHMM-server-v.html）预测PP2-A1蛋白跨膜结构。

1.2.3 糖基化位点预测及磷酸化位点预测 应用NetNGlyc1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）和NetOGly4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）在线软件分别对黄瓜PP2-A1蛋白的N-糖基化位点和O-糖基化位点进行分析预测。利用Net Phos 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/）预测其磷酸化位点。

1.2.4 二、三级结构预测 利用ExPAsY SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）软件对该蛋白质二级结构进行预测;使用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2_output/）软件同源建模法预测目的蛋白三级结构。

1.2.5 系统进化树 构建在线搜索美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库的BlastP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具，提交黄瓜PP2-A1蛋白序列，BLAST分析目的蛋白同源性序列，找出与黄瓜PP2-A1蛋白同源性高的蛋白序列，应用ClustalX程序对蛋白序列进行多序列比对，采用系统发育分子进化分析软件MEGA（Ver.5.0），基于Neighbor-Joining distance（邻近距离法）算法，利用Poisson correct modetionl构建系统进化树[12]，研究黄瓜PP2-A1蛋白序列发育情况。

1.2.6 结构域及功能位点预测 应用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/help/smart_glossary.shtml）在线提交PP2-A1蛋白的氨基酸序列，对其蛋白结构功能域的功能位点进行预测。

2 结果与分析

2.1 黄瓜PP2-A1蛋白的理化性质分析及疏水性结构预测

用ProtParam预测分析黄瓜PP2-A1蛋白的理化性质，分析结果显示，黄瓜PP2-A1蛋白含154个氨基酸，预测分子量为17 540.9 u，理论等电点（pI）为7.76，正电荷残基数为13个，负电荷残基数为12个，总共包含2 419个原子，分子式为 C787H1 183N223O218S8，黄瓜PP2-A1蛋白的不稳定指数为46.78（>45为不稳定），碱性氨基酸赖氨酸含量较高，此蛋白呈弱堿性。蛋白的总平均亲水性为-0.184，说明蛋白为不稳定弱碱性亲水蛋白。用在线软件ProtScale预测分析PP2-A1蛋白的疏水性结构，分析结果见图1，亲水性/疏水性最小值为-2.456，最大值为1.344，总体表现为亲水性。这与之前的分析相互验证。

2.2 黄瓜PP2-A1蛋白的亚细胞定位、信号肽以及跨膜结构分析

典型的跨膜螺旋区主要是由20～30个疏水性氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丙氨酸等）组成;亲水残基往往出现在疏水残基之间，对蛋白质功能有重要的作用。用在线软件TMHMM Server v. 2.0基于HMM方法的蛋白质跨膜区预测工具，分析黄瓜韧皮部基因编码的蛋白跨膜结构，结果显示该基因编码的蛋白不存在跨膜结构，不可能是膜上的受体或定位于膜上。用在线软件SignalP4.0分析黄瓜凝集素PP2-A1蛋白，最后的计算结果为“NO”，表明该基因编码的蛋白无信号肽。通过在线软件SubLocV1.0对蛋白质亚细胞进行定位，分析发现，该蛋白可能存在于细胞周质中。

2.3 黄瓜PP2-A1蛋白的糖基化位点预测及磷酸化位点预测

N-糖基化是指糖链通过N-乙酰葡萄糖胺连接到蛋白质上保守序列N-X-S/T中的天冬酰胺的氨基侧链上[13]，结果如图2所示，利用NetNGlyc软件对其N-糖基化位点分析可知，黄瓜PP2-A1蛋白可能有2个N-糖基化位点，分别为第21、第77位的天冬酰胺残基，因此黄瓜PP2-A1蛋白应该具有N-糖基化机制，用NetOGlyc分析软件对黄瓜PP2-A1蛋白的O-糖基化位点预测，结果表明黄瓜PP2-A1蛋白没有潜在的O-连接糖基化位点。对黄瓜PP2-A1蛋白的磷酸化位点分析发现（图3），目的蛋白有4个丝氨酸位点、4个苏氨酸位点、1个酪氨酸位点。

2.4 黄瓜PP2-A1蛋白的二级结构预测分析

PP2-A1蛋白的二级结构预测分析结果如图4所示，图中由短至长的竖线依次为无规则卷曲、β转角、延伸链、α螺旋。结果显示，该蛋白包含43.51%无规则卷曲（random coil）、35.70%延伸链（extended strand）、13.64α螺旋（alpha helix）、7.14%β转角（beta turn）。因此，黄瓜PP2-A1蛋白的二级结构中多为无规则卷曲和片层结构。

2.5 黄瓜PP2-A1蛋白的三级结构预测分析

用Phyre2在线软件预测黄瓜PP2-A1蛋白的三级结构，获得的黄瓜韧皮部凝集素的3D模型如图5所示，与二级结构的分析结果一致，该蛋白主要由无规则卷曲、延伸链和α螺旋组成。

2.6 构建黄瓜PP2-A1蛋白的系统进化树

利用NCBI网站Blastp比对黄瓜PP2-A1蛋白的同源序列，下载与PP2-A1蛋白相似性较高的甜瓜（Cucumis melo）、南瓜（Cucurbita moschata）、笋瓜（Cucurbita maxima）等物种的氨基酸序列，使用ClustalX2.1软件对黄瓜PP2-A1蛋白序列进行多序列对比。运用MEGA5.0软件构建基于PP2家族不同氨基酸序列的进化树，结果如图6所示，可以看出黄瓜

（Cucumis sativus）PP2蛋白与甜瓜PP2蛋白在同一分枝上聚为同一类，相似性为68.18%，说明甜瓜与其亲缘性较近;其与另一个分枝上的葫芦科南瓜属的日本南瓜（Cucurbita argyrosperma）相似性为27.93%，与笋瓜和金瓜（Cucurbita digitata）的相似性同为27.80%，与南瓜的相似性为25.68%。

2.7 黄瓜PP2-A1蛋白的结构域及功能位点预测

根据SMART分析结果显示，该蛋白具有一个典型的韧皮部蛋白2功能结构域，在该序列的氨基酸位置为12～153;对其编码蛋白的功能位点进行预测，发现该序列包含3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个N-豆蔻酰化位点、1个蛋白激酶C磷酸化位点、2个N-糖基化位点（表1）。

3 讨论与结论

基于生物信息学的角度，利用分子生物信息学各种相关软件的手段，分析黄瓜PP2-A1蛋白序列的生物学特征，发现该蛋白是由20种氨基酸组成的一种不稳定的亲水性蛋白质，对PP2-A1蛋白的信号肽、跨膜结构和亚细胞定位分析，发现其不具备信号肽段，没有跨膜结构，并且在膜内定位的概率几乎为0，故该蛋白质为非分泌非跨膜的膜外（胞质）蛋白质。分析其二级结构，发现该基因编码蛋白质中无规则卷曲和延伸链所占的比重较大，结合对其三级结构的预测，证实了该蛋白质的肽链主要以无规则卷曲和延伸链为主。有研究表明，无规则卷曲经常构成酶活性部位和特异性功能部位[14]，而研究表明来自葫芦科的韧皮部蛋白2是一种表达量很高的韧皮部蛋白，其mRNA高度保守且具有韧皮部组织特异性，并且能在植物体受到侵害时发生韧皮部防卫反应，对于抵抗外界环境中生物以及非生物胁迫具有重要作用[15]。并且由在线软件分析得出，黄瓜PP2-A1基因编码的蛋白含有N-糖基化位点，前人研究也表明，韧皮部蛋白2（PP2）是一种优先特异结合N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体的、大小为49 ku亚基的二聚体蛋白。经过对黄瓜PP2-A1蛋白的同源性分析发现，黄瓜与甜瓜的亲缘关系比较近，与南瓜属的日本南瓜、笋瓜等比较接近，这与植物传统分类表上的分类关系基本一致。同时分析其结构功能域时发现，在12～153有1个典型的PP2（韧皮部蛋白2）功能域，表明该基因是PP2基因家族的一个成员。

總之，本研究从生物信息学角度，以黄瓜PP2-A1基因编码的蛋白为分析对象，对PP2-A1基因推导的氨基酸序列结构特征进行分析，同时对其整个肽链的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜结构和亚细胞定位、糖基化位点、磷酸化位点及其二、三级结构特征等进行预测分析，并构建黄瓜韧皮部蛋白亲缘关系的进化树，同时也对黄瓜PP2-A1蛋白的结构域及功能位点进行预测，为进一步研究蛋白质的高级结构及探寻黄瓜PP2-A1基因的潜在功能提供参考。利用分子生物信息学手段，基于已获得的黄瓜韧皮部蛋白编码信息，对黄瓜韧皮部蛋白进行结构、特征及亲缘关系分析，可增进对黄瓜韧皮部蛋白的认识，利于从分子水平上解释和挖掘黄瓜韧皮部蛋白的生物功能，为后续研究黄瓜PP2-A1基因试验奠定基础。

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