烘烤过程中烟叶主脉腐烂及霉变症状分析

高娅北，娄晓平，陈二龙，张保全，张仲文，史久长，陈小翔，宋朝鹏*

1. 河南农业大学烟草学院，郑州市农业路63 号 450002

2. 浙江中烟工业有限责任公司，杭州市中山南路77 号 310004

烟叶腐烂和霉变是烘烤过程中所发生的烤坏烟的常见类型，严重影响烟叶品质，造成经济损失，给烟叶生产带来极大的影响［1-2］。因此，探究烟叶在烘烤过程中的腐烂和霉变发生规律及机制对提高烤烟产量及品质具有重要意义。扫描电镜具有高分辨率、视野范围广、富有立体感等特点，可用于观测烟叶的变化。王亮等［3］通过扫描电镜研究了烟梗和烟叶的形态结构；过伟民等［4］采用扫描电镜观测各部位烟叶微观结构的差异；宁敏等［5］通过该方法研究了再造烟叶的形貌结构；陈二龙等［6］利用扫描电镜分析了烘烤过程中霉变烟叶的组织微观结构，表明随着烘烤时间的延长，主脉逐渐破损，异物逐渐增加，霉菌逐渐增多，至完全覆盖于主脉端口，但异物的主要成分和含量尚不明确。能谱仪具有直观呈现目标元素含量及分布特征，且无损测定、分辨率高和测定速度快等特点，目前已广泛应用于烟叶成分的研究中，但主要集中在再造烟叶［7-10］和不同施肥量对烟叶元素含量与分配的影响方面［11］，而用于烟叶腐烂和霉变的研究较少。因此，采用扫描电镜对腐烂和霉变烟叶主脉的微观结构进行研究，并采用能谱技术对主脉及其在腐烂和霉变过程中分泌异物的主要成分和含量进行测定，旨在揭示烘烤过程中烟叶的腐烂和霉变机制，为防控烟叶腐烂和霉变提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2017 年设置在河南农业大学科教园区。供试品种为云烟85，土壤肥力均匀，适中，土壤pH 7.67，田间输水系统通畅；按优质烟生产技术规范进行大田管理和采收；采收烟叶为叶面积和叶色较为一致的中部（第9～11 片）适熟烟叶。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

参照陈二龙等［12］的方法将试验烟叶放置于烘烤过程中易于发生腐烂和霉变的条件下烘烤（气流上升式四层密集烤房顶层，相对湿度≥99.9%），参照三段式烘烤工艺进行参数设定［13］。参考陈二龙等［6］的方法取烘烤前鲜烟叶和烘烤24 h 腐烂和霉变的烟叶，去除两侧叶耳，取主脉端口组织进行样品制备，用于扫描电镜测试。设置3次生物学重复。

1.2.2 扫描电镜观察和能谱检测

取制备样品，快速滴加数滴2.5%戊二醛固定液（4 ℃，由美国Alfa Aesar 公司生产的25%戊二醛配制而成），采用吉列双刃刀片于载玻片上取1 mm厚度的烟叶主脉端口截面作为样品，置于装有2.5%戊二醛固定液的样品瓶中。同时采用注射器抽取气体，直至样品下沉悬浮于固定液中。利用封口膜封口，在4 ℃条件下放置4 h，使样品充分固定。用0.1 mol/L 磷酸缓冲液（PB, pH7.0）冲洗固定样，1%的锇酸溶液（美国Ted Pella 公司）进一步固定样品，经乙醇系列脱水（国产无水乙醇配制成30%、50%、70%、85%、95%和100%乙醇溶液），临界点干燥，喷金镀膜，使用Quanta 200 扫描电镜（荷兰FEI 公司），于20 kV 条件下观察样品，采用X 射线光电子能谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）测定元素含量（质量分数）［14-15］。

2 结果与分析

2.1 腐烂和霉变烟叶特征分析

烤后腐烂和霉变的烟叶主要表现为叶基部腐烂呈褐色，且含有灰色的霉菌菌丝，但腐烂区域大于霉变区域（图1A），与烘烤中烟叶腐烂和霉变的特点有关，见图1B～F。烟叶在烘烤过程中，主脉端口首先产生褐变，随后发生腐烂（图1B）；烟叶主脉组织坏死为霉菌的生长繁殖创造了条件。因此，霉变首先发生在烟叶主脉端口（图1C），烟叶腐烂区域的四周呈现放射状，方向和位置与主支脉有关（图1D）。烟叶霉变状态与腐烂状态相似，由端口向主脉、支脉以及向两侧有一定的扩展（图1E、F）。因此，烟叶腐烂发生时间早于烟叶霉变，烟叶腐烂和霉变均以主、支脉为主，然后向两侧扩散，且烟叶腐烂扩散速度大于霉变扩散速度。可见，烤后烟叶腐烂区域大于霉变区域。

2.2 腐烂和霉变烟叶主脉微观结构分析

鲜烟叶及烘烤过程中腐烂和霉变的主脉微观结构通过环扫电镜观测结果见图2。烘烤前鲜烟叶主脉的薄壁细胞结构相对完整，轮廓较为清晰，由表皮至中柱，细胞逐渐增大（图2A）。在烘烤过程中，细胞壁被破损，且产生大量晶体，位于截面表层或细胞腔内，部分晶体聚集成簇（图2B）；烟叶主脉分泌的晶体多呈现四边或五边形，厚度为细胞壁的2 倍左右，晶体内部具有规则的四边形空隙结构，且各空隙之间的间隔较为一致（图2C）。霉菌菌丝生长于晶体上（图2D）；此外随着细胞结构破损和晶体量的增加，霉菌大量生长繁殖，且菌丝具有分支（图2E）。因此，烟叶腐烂发生先于烟叶霉变，且发生霉变的菌丝依附在晶体上。

2.3 腐烂和霉变烟叶能谱测定

图1 烘烤期间烟叶腐烂和霉变特征Fig.1 Characteristics of mildew and rot of tobacco leaves during flue-curing

图2 腐烂和霉变烟叶主要位置的微观结构Fig.2 Microstructure of main positions of moldy and rotten tobacco leaves

由于环扫电镜观察到霉变菌丝着生于烟叶主脉细胞所分泌的晶体上，因此，通过X 射线能谱仪分析主脉细胞和晶体的主要元素，结果见图3 和表1。S1、S2 和S3 均含有Ca、Na 和O，但3 种元素含量存在较大差异，其中S1 的Na 和O 元素含量均最高，而S3 相应的元素含量最低，但S3 的Ca 元素含量大于S1，而S2 介于两者之间。除以上3 种元素之外，S1、S2 和S3 含有的元素种类存在差异。S1 检测出C，未检测出P；S3 检测出P，未检测出C；S2 含有C 和P。可见，晶体并非细胞壁的破损成分，而为烘烤过程中烟叶自身代谢的产物，且该产物具有一定的特异性。

图3 不同测定点的能谱图Fig.3 Energy spectrum of different measurement points

表1 不同测定点的主要元素含量Tab.1 Contents of main elements at different determination points （%）

3 讨论

本研究结果表明，在烘烤过程中烟叶先腐烂、后霉变，这种变化规律与陈二龙等［6］的研究结果一致。原因可能是由于抗性较弱的组织易引发腐烂病原菌的入侵和扩增，致使组织坏死，从而有助于霉菌入侵，并为霉菌的生长繁殖创造营养条件所引起的［16-18］；本试验中，烟叶腐烂和霉变发生顺序依次为主脉、支脉和叶片，这种变化规律可能与烟叶中的水分分布有关，因为植物组织含水率越高，越易发生腐烂和霉变［19-20］，而烟叶中含水率为主脉＞支脉＞叶片［21-22］，因此烟叶腐烂和霉变呈现该规律；烘烤过程中烟叶腐烂和霉变大部分只发生在烟叶的叶基部，部分蔓延至叶中部，但很少能蔓延至叶尖，这可能也是由于烟叶整体含水率表现为叶基＞叶中＞叶尖所引起的［23］。

烟叶主脉薄壁细胞中含有的一定量的草酸钙砂晶［24］，具有解毒、防御和平衡离子的作用［25-26］。有研究表明，在一定条件下诱导特定时间即可在植物体内合成草酸钙砂晶，其形状一般为针形、菱形片状或是片形簇状，元素组成为Ca、C 和O，多沉积在茎、叶主脉或叶肉细胞中［27-32］。本试验条件下，烘烤过程中腐烂烟叶的主脉细胞中分泌出大量晶体，呈现清晰的菱形片状，通过与前人对烟草中草酸钙砂晶的研究结果比对，发现其形状大小具有较高的相似度［33］；通过能谱检测发现该晶体也含有大量Ca 和O 元素，其元素组成也与其他作物中的草酸钙砂晶较为一致，且产生于主脉薄壁细胞中，与多数植物草酸钙砂晶的沉积部位相同；因此推测该晶体为草酸钙砂晶。由于该晶体出现于腐烂烟叶的主脉细胞中，且具有解毒、防御等作用，因此推测在本研究中烟叶主脉细胞分泌晶体这一行为是主脉在腐烂时自身机体为抵御病菌侵染、修复破损屏障的自体应激反应。在烘烤过程中霉变烟叶的霉菌菌丝着生于晶体上，可能是由于草酸钙砂晶中含有大量的Ca 元素，而Ca 能够促进菌丝生长所引起的［34］。此外，该晶体含有一定量的P 元素，而P 具有抑制菌丝生长的作用［35］，与晶体促进菌丝生长的结果相反，可能是由于P元素含量相对较低或不同种类霉菌抑制作用存在差异所致；除此之外，P 元素能以磷酸根的形式调控草酸钙砂晶形貌和尺寸，从而避免晶体过大或浓度过高造成对植物的伤害［36］，因此烟叶主脉分泌的晶体中所含有的P 元素可在一定程度上调控晶体的尺寸和浓度，从而避免晶体的尺寸和浓度对烟叶造成不利影响。但目前有关腐烂烟叶主脉细胞草酸钙砂晶的产生机制还有待进一步深入研究。

4 结论

在烘烤过程中，烟叶腐烂发生时间、扩散速度均先于霉变，且二者发生部位一致，均首先发生于主脉，而后向两侧叶肉延伸；烟叶腐烂时，主脉产生菱形片状晶体，晶体中含有30.34%的Ca、44.40%的O、24.92%的P，以及0.34%的Na 元素，推测该晶体可能为草酸钙砂晶，通过扫描电镜观察到烟叶霉变产生的霉菌菌丝着生于该晶体上。可见，烟叶霉变和腐烂主要发生在叶基部叶脉，烟叶腐烂产生的含Ca 草酸钙砂晶促进了烟叶霉变。