香菊颗粒中黄芪甲苷含量测定方法的改进及其与原方成分的一致性研究Δ

孙晨曦，葛鼎，王素梅，郭康，王举涛#（.安徽中医药大学药学院，合肥300；.陕西雪龙海姆普德药业股份有限公司，陕西 渭南 74000）

香菊颗粒（国药准字：Z10980117）是根据民间验方采用现代化制剂技术制成的颗粒剂型中成药，主要由化香树果序、夏枯草、黄芪、防风、甘草、野菊花、白芷、辛夷、川芎等9种药材经传统煎煮工艺提取后，再加入适量辅料而制成；其具有辛散祛风、清热解毒、活血化瘀、通窍止痛、消肿排脓等功效，以及镇痛、抗炎、增强免疫、广谱抗菌、抗病毒等药理活性，在临床上主要用于急慢性鼻炎、鼻窦炎的症状缓解与治疗[1-9]。香菊颗粒质量标准收载于《国家药品标准：新药转正标准》第38册，该标准主要是采用薄层扫描法测定黄芪甲苷含量[10]，然而在以往实践过程中发现该方法重现性较差。基于此，本研究在以往相关研究的基础上，采用高效液相色谱-蒸发光散射法（HPLC-ELSD）对黄芪甲苷进行含量测定，以进一步完善香菊颗粒的质量控制方法。

目前市面上香菊颗粒的同方制剂还有香菊胶囊、香菊片，且已广泛用于临床。有研究表明，现代化中药工业药剂生产过程会对古方或经验方的有效成分产生影响[11]，而中药复方制剂功效发挥的基础正是原方药材中药理活性成分的保留，因此通过对比中药制剂在水中的释药情况，可反映不同剂型间对原方成分种类和含量的保留程度。考虑到中药复方的化学成分较为复杂，是多个组分之间相互作用以共同发挥药效，仅以单个或几个有效成分对其进行质量控制无法完全体现中药复方的整体性，因此建立中药制剂释放成分的特征指纹图谱并评价其相似度，可更全面地评价不同制剂对原方成分的保留情况；同时，结合对不同香菊制剂与原方提取物中主要有效成分黄芪甲苷的释放度的比较，可从整体和单一成分的双重角度，评价原方进行现代化工艺制剂的有效性、合理性和一致性，从而为确保中药复方的临床疗效提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱（HPLC）仪（美国Agilent公司）；Alltech 2000型蒸发光散射（ELSD）检测器[美国奥泰科技（中国）有限公司]；LC-10A型HPLC仪（日本Shimadzu公司）；B135-S型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ220型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

市售香菊颗粒（陕西雪龙海姆普德药业股份有限公司，批号：171114）；香菊制剂原方干膏粉（批号：YFGGF01、YFGGF02、YFGGF03、YFGGF04、YFGGF05、YFGGF06）、缺黄芪原方干膏粉（批号：YXYFGGF01）均为本课题组按处方工艺煎煮提取、干燥后制得；香菊颗粒（批号：XJKL01、XJKL02、XJKL03）、香菊胶囊（批号：XJJN01、XJJN02、XJJN03）、香菊片（批号：XJP01、XJP02、XJP03）均为本课题组以香菊制剂原方干膏粉添加相应辅料制得；糊精、蔗糖粉、甘露醇等药用辅料均购自河南鲁尔康药业有限公司。

2 黄芪甲苷含量测定方法的改进

2.1 HPLC-ELSD法测定香菊颗粒中黄芪甲苷的含量

参考2015年版《中国药典》（一部）“黄芪”项含量测定方法[12]与相关文献[13-15]，采用HPLC-ELSD法测定香菊颗粒中黄芪甲苷的含量。

2.1.1 黄芪甲苷对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品5.38 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.538 mg的对照品溶液。

2.1.2 样品溶液与阴性样品溶液的制备 （1）取市售香菊颗粒1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加水饱和正丁醇50 mL，密塞，称定质量，静置过夜后超声提取（功率：100 W，频率：40 kHz）1.0 h并适当振摇；放冷，用水饱和正丁醇补足减失质量，然后转移至分液漏斗中，以40%氨水充分洗涤2次，每次40 mL；取上层正丁醇液减压蒸干，回收溶剂；残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得样品溶液。（2）取缺黄芪原方干膏粉，按处方工艺制得缺黄芪香菊颗粒阴性样品，取1.0 g，同“（1）”项下方法配制阴性样品溶液。

2.1.3 色谱条件与ELSD参数 （1）色谱条件：采用1260型HPLC仪测定。色谱柱为Epic C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（32∶68，V/V）；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样体积为10 L。（2）ELSD参数：漂移管温度为115℃；喷嘴温度为105℃；载气为净化压缩空气；载气流速为3 L/min；光电管信号放大倍数为2倍。

2.1.4 系统适用性考察 分别取“2.1.1”“2.1.2”项下对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液各适量，按“2.1.3”项下条件进样分析，记录色谱图。结果显示，黄芪甲苷保留时间为24.790 min，分离度为3.89，理论板数为7 842，且阴性样品对测定无干扰，详见图1。

2.1.5 线性关系考察 精密称取黄芪甲苷对照品4.20mg，置于2 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得质量浓度为2.10 mg/mL的对照品溶液Ⅰ；精密吸取对照品溶液Ⅰ适量，以甲醇梯度稀释，制得质量浓度分别为1.05、0.52、0.26、0.13 mg/mL的系列对照品溶液Ⅱ～Ⅴ。取上述对照品溶液Ⅰ～Ⅴ，按“2.1.3”项下条件进样分析，记录色谱图。以黄芪甲苷质量浓度的常用对数值（x）为横坐标、色谱峰面积的常用对数值（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y＝1.064 4x+5.895 7（r＝0.999 1），表明黄芪甲苷检测质量浓度的线性范围为0.13～2.10 mg/mL。

2.1.6 精密度试验 取同一样品溶液（批号：171114），按“2.1.3”项下条件连续进样分析6次。结果，黄芪甲苷峰面积的RSD为0.64%（n＝6），表明仪器进样精密度良好。

2.1.7 重复性试验 取同一批样品（批号：171114），共6份，按“2.1.2”项下方法配制样品溶液，再按“2.1.3”项下条件进样分析，以外标两点法计算黄芪甲苷含量。结果，黄芪甲苷的平均含量为0.398 mg/g，RSD为1.93%（n＝6），表明本方法重复性良好。

现场植被群落调查方法采用样方法，分别在子坝平台、子坝边坡和尾矿库库面三个区域选择12个经过复垦的人工群落进行。样方内尽量包含群落中绝大多数植物，其中草本采用1×1=1 m2的样方，灌木采用4×4=16 m2的样方，乔木采用10×10=100 m2的样方。

图1 黄芪甲苷的系统适用性色谱图Fig 1 System suitability chromatograms of astragalosideⅣ

2.1.8 回收率试验 精密称取黄芪甲苷对照品4.28 mg，置于20 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得质量浓度为0.214 mg/mL的加样回收对照溶液。精密量取该对照溶液1.0 mL，共6份，分别置于6个锥形瓶中（编号1～6），水浴蒸干后，分别加入已知黄芪甲苷含量的样品颗粒（批号：171114，黄芪甲苷含量：0.398 mg/g）约0.5 g，按“2.1.2”项下方法配制样品溶液，再按“2.1.3”项下条件进样分析，以外标两点法计算黄芪甲苷含量，并计算加样回收率。结果，黄芪甲苷的平均加样回收率为97.66%，RSD为1.01%（n＝6），表明本方法准确度良好，详见表1。

表1 加样回收率试验结果Tab 1 Results of recovery tests

2.1.9 稳定性试验 取同一样品溶液（批号：171114），在室温25℃、相对湿度45%的条件下放置，并按“2.1.3”项下条件每隔2 h进样测定1次，共测定6次。结果，黄芪甲苷峰面积RSD为2.16%（n＝6），表明样品溶液在上述条件下放置10 h内稳定性良好。

2.2 新建方法与原标准含量测定方法的比较

取市售香菊颗粒（批号：171114）适量，平行操作3份，分别采用本文建立的HPLC-ELSD法和原标准的薄层扫描法[9]测定黄芪甲苷的含量。结果，HPLC-ELSD法所测黄芪甲苷含量分别为0.398、0.394、0.402 mg/g，平均含量为0.398 mg/g（RSD＝1.01%，n＝3）；薄层扫描法所测黄芪甲苷含量分别为0.374、0.399、0.381 mg/g，平均含量为0.385 mg/g（RSD＝3.35%，n＝3），表明HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷含量较薄层扫描法偏差更小。

3 不同香菊制剂与原方成分一致性比较

3.1 不同香菊制剂与原方干膏粉的水中释放成分特征图谱比较

3.1.1 色谱条件 采用LC-10A型HPLC仪测定。色谱柱：Thermo Hypersil GOLDTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，10%A；10～50 min，10%A→18%A；50～70 min，18%A；70～95 min，18%A→25%A；95～110 min，25%A→40%A；110～120 min，40%A；120～135 min，40%A→70%A；135～140 min，70%A→10%A；140～150 min，10%A）；检测波长：270 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：5µL。

3.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取升麻素苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸、迷迭香酸、蒙花苷、木兰脂素的对照品适量，加甲醇分别制成质量浓度均为50µg/mL的单一对照品溶液，以0.22µm滤膜滤过，即得。

3.1.3 供试品溶液的制备 称取原方干膏粉（批号：YFGGF01）0.6 g，并根据不同制剂处方中辅料添加量称取均相当于等量干膏粉的自制香菊颗粒（批号：XJKL01）、香菊胶囊（批号：XJJN01）内容物、香菊片（批号：XJP01）粉末各适量，平行操作6份，精密称定，分别加入37℃的水150 mL，搅拌使分散均匀，过滤；精密移取15 mL滤液蒸干，加甲醇定容至1 mL，以0.22 μm滤膜过滤，即得。

3.1.4特征峰指认分别取“3.1.2”“3.1.3”项下的对照品溶液、供试品溶液各适量，按“3.1.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图（见图2）。结果，根据各对照品溶液出峰时间，确定供试品溶液色谱图中升麻素苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸、木兰脂素等8个成分的出峰时间分别为26.983、29.989、33.550、35.267、57.846、88.304、113.729、114.648 min，分别表征香菊制剂原方中的防风、川芎、黄芪、甘草、夏枯草、野菊花、辛夷[12]。

3.1.5 不同制剂在水中的释放成分相似度评价 取原方干膏粉6批样品适量，按“3.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“3.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图并录入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）》，生成对照特征图谱；另取自制香菊颗粒、香菊胶囊、香菊片各3批样品，同法制备供试品溶液并进样测定，记录色谱图，并与对照特征图谱进行比较，结果见图3。经该软件计算显示，自制香菊颗粒、香菊胶囊、香菊片与原方干膏粉释放成分特征图谱之间的相似度均达0.850以上，各制剂间相似度也均在0.820以上，详见表2。由此表明，不同香菊制剂特征图谱相互比较，以及其与对照特征图谱比较差异均较小，提示不同制剂中所含成分与原方成分较为接近。

图2 系统适用性特征图谱Fig 2 System suitability characteristic chromatograms

图3 不同制剂与原方干膏粉（对照）溶出成分的特征图谱Fig 3 Characteristic chromatograms of dissolution components from different preparations and original formulation dry extract powder（control）

表2 不同制剂与原方干膏粉溶出成分特征图谱的相似度Tab 2 Characteristic fingerprint similarity of dissolution components from different preparations and original formulation dry extract powder

3.2 不同香菊制剂与原方干膏粉中黄芪甲苷释放度比较

以黄芪甲苷水中释放度为指标[16-17]，比较自制香菊颗粒、香菊胶囊、香菊片与原方成分的一致性。

3.2.1 样品溶液制备 按“3.1.3”项下方法称取原方干膏粉（批号：YFGGF01）0.6 g和均相当于等量干膏粉的自制香菊颗粒（批号：XJKL01）、香菊胶囊（批号：XJJN01）内容物、香菊片（批号：XJP01）粉末适量，平行操作6份，精密称定，加37℃水150 mL，搅拌使分散均匀，过滤；精密移取滤液50 mL，转移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇萃取3次，每次30 mL；合并正丁醇萃取液，以40%氨水充分洗涤2次，每次40 mL；取上层正丁醇液减压蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

3.2.2 黄芪甲苷释放度比较 取“3.2.1”项下样品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，以外标两点法计算黄芪甲苷含量，并计算释放度[释放度＝黄芪甲苷测得质量浓度（mg/mL）×水体积150 mL]。结果显示，相当于0.6 g原方干膏粉的香菊颗粒、香菊胶囊、香菊片样品中黄芪甲苷平均释放度分别为0.392、0.358、0.349 mg，详见表3。采用SPSS 24.0统计学软件进行单因素方差分析对结果进行检验，方差齐则采用双侧Dunnett-t检验对不同香菊制剂与原方干膏粉测定结果进行比较。结果显示，香菊颗粒中黄芪甲苷的释放度与原方干膏粉比较差异无统计学意义（P＞0.05），而香菊胶囊、香菊片与原方干膏粉之间差异有统计学意义（P＜0.01），详见表4。

表3 不同制剂与原方干膏粉在水中的黄芪甲苷释放度（mg）Tab 3 Release rate of astragalosideⅣfrom different preparations and original formulation dry extract powder in water（mg）

表4 不同制剂与原方干膏粉黄芪甲苷释放度的统计学检验结果（n＝6）Tab 4 Statistical test results of release rates of astragalosideⅣfrom different preparations and original formulation dry extract powder（n＝6）

4 讨论

香菊颗粒具有辛散祛风、清热通窍的作用，常用于缓解和治疗急慢性鼻炎、鼻窦炎等[9]。香菊颗粒原质控成分黄芪甲苷的含量测定方法为薄层扫描法，但该方法存在重复性差、空白干扰严重等问题。为修订、完善其质控方法，本课题组采用HPLC法对黄芪甲苷进行测定。由于黄芪甲苷属于三萜类皂苷，其紫外检测信号较弱[13]，因此本课题组采用ELSD检测器进行检测。ELSD检测器可弥补紫外检测器的弱势检测区域，广泛应用于如皂苷类、内酯类、糖类及部分生物碱类等成分的定量分析[18]。在前期试验过程中，本课题组对样品溶液的制备方法进行了研究，先后对提取方式、提取溶剂等过程进行了考察。结果发现，纯有机溶剂对样品中黄芪甲苷的溶解效果均不理想，而水饱和正丁醇用于溶解待测成分效果最好。

基于中药复方成分复杂，本研究从整体化学特征及有效单一成分两方面同时评价不同香菊制剂在水中的释放成分，并与原方干膏粉进行比较。综合原方中黄酮类、酚酸类及木质素类成分，本课题组前期对供试品溶液采用二极管阵列检测器进行全波长扫描（190～400 nm），结果发现各组分在270 nm波长处均有明显吸收，因此选择其作为检测波长。经测定，获得不同香菊制剂在水中释放成分的特征图谱，并标定了8个特征峰；相似度分析结果显示，不同香菊制剂与原方干膏粉特征图谱的相似度达到0.850以上，提示其在水中释放的成分较为接近。进一步对主要有效成分黄芪甲苷的释放度进行测定和统计学比较，结果显示，香菊颗粒中黄芪甲苷的释放度与原方干膏粉之间差异无统计学意义（P＞0.05），而香菊胶囊、香菊片与原方干膏粉之间差异有统计学意义（P＜0.05）。

综上所述，本研究所建立的HPLC-ELSD法准确、可行，可用于香菊颗粒中黄芪甲苷的含量测定。香菊颗粒与原方干膏粉在水中释放成分的特征图谱接近，且主要有效成分黄芪甲苷释放度基本一致，表明将原方制成香菊颗粒后，制剂中所含成分能够与原方保持一致；香菊胶囊和香菊片与原方干膏粉在水中释放成分的特征图谱相似度也较高，但主要有效成分黄芪甲苷在水中的释放度存在一定差异。上述结果提示，中药复方不同制剂之间存在一定差异，今后需要通过药效物质基础研究来佐证中药复方不同制剂的治疗效果。