姜黄素对β-淀粉样蛋白损伤神经干细胞增殖和凋亡的影响

信嘉轩 教传华 商 华 朱雁飞 肖韩艳 李 丽 李文媛

牡丹江医学院附属第二医院，黑龙江牡丹江 157001

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人群中常见的一组病因未明的中枢神经系统退行性疾病，特别是对于年龄＞65 岁的老年人，女性更常见[1-3]。该病主要表现为持续的认知功能障碍以渐进性记忆障碍、认知功能丧失伴日常生活能力下降和行为改变为特征，其发病率随年龄增加而不断增高。AD 显著增加了家庭的负担，且发病率逐年增加，已成为一个全球的健康问题[4-6]。AD 典型的病理特征主要表现为细胞外淀粉样蛋白沉积形成老年斑、细胞内Tau 蛋白高度磷酸化形成神经元纤维缠结以及神经元大量凋亡。β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）的生成和聚集在AD的发病中起核心作用。Aβ 被认为在神经干细胞（NSC）中具有强大的神经毒性。NSC 是自我更新的多能细胞，迁移到最终的位置和功能，成为神经元或胶质细胞。然后，基于NSC 治疗的临床发展仍处于起步阶段。姜黄素是一种多酚类化合物，提取自中药姜黄，可用作香料、食用色素和传统草药，具有抗氧化、抗炎、抗癌、改善脑功能、控制肥胖和糖尿病等保健作用[7-8]。相关研究结果表明，姜黄素具有多效性，调节转录因子（如NF-kB）、细胞因子（如 IL6， TNF-α）、粘附分子（如ICAM-1）和酶（如 MMPs），在炎症和恶性肿瘤中起主要作用[9-11]。姜黄素对Aβ 诱导的NSC 损伤是否具有保护作用尚待研究。本研究旨在探讨姜黄素对Aβ 诱导的NSC 损伤的影响。

1 资料与方法

1.1 NSC的提取与分组

选取孕14.5d 的 C57/BL6 小鼠，购买于昆明医科大学实验动物中心，合格证号SCXK（滇）-2011004。取胎鼠前脑的侧脑室颗粒下层，剪碎，消化为单个细胞，将细胞重悬于12 孔板。体外培养5 ～7d，取5 ～7 代NSC 用 于 实 验。将NSC 随机分为对照组、姜黄素组、Aβ 组和观察组，分别加入DMSO（10 μL）、5 μmol/L 姜黄素10 μL、0.5 μmol/L Aβ 溶液（10μL）及DMSO（10μL）、5 μmol/L 姜黄素和0.5μmol/L Aβ 溶液 10 μL。

1.2 噻唑蓝（MTT）测定细胞活力

NSC 置于96 孔板，每孔加入0.2mL NSC 贴壁培养基并给予处理，体外培养48h，采用MTT 法检测细胞活性，使用酶标仪（美国Molecular Devices 公司，型号FlexStation 3）450nm 测定吸光度。细胞活力=（吸光度/溶剂空白对照组吸光度）× 100%。

1.3 RT-PCR测定

RT-PCR 测定NSC 中巢蛋白（Nestin） mRNA 及凋亡相关基因Caspase3 mRNA 表达。Trizol 试剂提取总RNA，按照 mRNA 试剂盒操作说明合成。RNA 纯度和浓度用紫外分光光度法测定。Caspase-3 引物上游序列：5’-CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG-3’，下游序列5’-GCATACTGTTTCAGCAGTTCA-3’，270bp。Nestin 上游 序 列：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下 游 序 列5’-TYGGCTCCACCCTTCAAGTG-3’。内 对 照 基 因β 肌 动 蛋 白（β-actin） 引物：5’-GTGGGGCGCCCCAGGC A C C A-3’，5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，682 bp。1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。每组重复3 次。

1.4 免疫组化染色

采用免疫组化染色检测神经细胞标记分子Tuj-1 和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。PBS液漂洗贴壁细胞后使用4%多聚甲醛固定细胞20min，0.3%的Triton-100 打孔15min，封固洗膜，用增强化学发光试剂盒显色、显影、定影。曝光后保存图片，采用Image J 软件计算阳性细胞数目。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 姜黄素对NSC活力的影响

与对照组比较，姜黄素组NSC 的细胞活力、Nestin mRNA 表 达 明 显 增 加，Caspase3 mRNA 表 达明显降低（P ＜0.05 或P ＜0.01），而Aβ 组和观察组NSC 活力、Nestin mRNA 表达明显降低，Caspase3 mRNA 表达明显增加，差异有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01）。与Aβ 组比较，观察组NSCs 细胞活力、Nestin mRNA 表达增加，Caspase3 mRNA 表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），见表1。

表1 姜黄素对NSC增殖及凋亡的影响（n=5）

2.2 姜黄素对NSC分化的影响

与对照组比较，Aβ 组Tuj-1、GFAP 比例明显减少（P ＜0.01）；姜黄素组Tuj-1 明显升高，GFAP 明显降低（P ＜0.05）；与Aβ 组比较，观察组Tuj-1、GFAP 明显增加（P ＜0.01），但明显低于对照组（P ＜0.05），见表2。

表2 各组Tuj-1和GFAP表达水平的比较（%）

3 讨论

AD 是一种具有破坏性的神经退行性疾病，治疗方法有限，Aβ 是AD 的一个标志，它在NSC 中具有强大的神经毒性[12]。NSC 是一类具有分裂潜能和自我更新能力的前体细胞，尽管NSC 领域的工作已超过20 年，但该领域仍处于起步阶段，因为目前对神经系统疾病中可用于改善中枢神经系统再生的基本机制的了解仍在不断增长，通过促进神经新生来治疗AD 已经成为了NSC 研究的主要方向之一，为神经系统退行性疾病的治疗开辟了新的方向。

近年来的研究表明，小胶质细胞分泌的分子在NSC 的细胞命运决定中起着重要作用[13]。Tuj-1 和GFAP 为神经细胞标记分子。GFAP 是中枢神经系统星形胶质细胞、周围神经系统非髓鞘雪旺细胞和肠内胶质细胞中唯一发现的中间丝Ⅲ蛋白。GFAP基因激活和蛋白诱导似乎在中枢神经系统损伤和神经退行性变后的星形胶质细胞激活（星形胶质细胞病）中起着关键作用。GFAP 及其分解产物迅速释放到生物流体中，使其成为此类神经疾病的有力候选生物标记物。

姜黄素是姜科姜黄属植物根茎的提取物，近年来，有研究结果究显示，姜黄素具有明显的神经保护作用，并且姜黄素可刺激胚胎神经前体细胞增殖，也可增强成年海马的神经发生[14-16]。姜黄素是一种天然小分子多酚类化合物，是姜黄中一种著名的二芳基庚烷类化合物，姜黄素有抗肿瘤活性[17]，能够抑制肿瘤细胞增殖，诱导多种肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞侵袭转移和血管生成，抑制某些酶活性，调节肿瘤细胞的信号传导等[18]。姜黄素的抗癌作用主要是由于肿瘤细胞凋亡通路的激活，以及抑制肿瘤微环境如炎症、血管生成和肿瘤转移等所引起的[19-26]。卢晓云等[27]研究发现姜黄素对AOM/DSS 致肠癌有一定的抑制作用，能通过调控Wnt/β-连环素信号通路阻断EMT 过程，起到防治结肠炎相关结直肠癌的作用。李新等[28]研究认为下调KLF8 基因表达和姜黄素均能通过抑制JAK2/STAT3 信号通路降低乳腺癌细胞活力，诱导细胞凋亡，两者联合对细胞活力及凋亡的影响作用更强。唐邓等[29]研究认为姜黄素在较低浓度时可促进胃正常上皮GES-1 细胞迁移及侵袭能力，姜黄素在高浓度（80μmol/L）时可抑制细胞迁移及侵袭能力，对胃正常上皮细胞及不同分化程度胃腺癌细胞的增殖抑制、诱导凋亡及迁移侵袭能力均呈剂量及时间依赖性。杨秦梅等[30]研究认为姜黄素抑制肺癌干细胞的增殖，诱导其凋亡与Notch 信号通路有关。

本研究通过测定nestin 的表达来鉴定NSC，并通过免疫荧光双重标记Tuj-1 和 GFAP 来评价NSC的分化，结果显示， 与对照组比较，姜黄素组NSC的细胞活力、Nestin mRNA 表达明显增加，Caspase3 mRNA 表 达 明 显 降 低（P ＜0.05 或P ＜0.01），而Aβ 组和观察组NSC 活力、Nestin mRNA 表达明显降低，Caspase3 mRNA 表达明显增加，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）；与Aβ 组比较，观察组NSCs 细胞活力、Nestin mRNA 表达增加，Caspase3 mRNA 表达明显降低，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01），提示姜黄素能增加NSC增殖速度，增加NSC 活力，促进NSCNestin 蛋白mRNA 表达，降低凋亡蛋白Caspase3 mRNA 表达，逆转AB 对NSC 的损伤，姜黄素的神经保护作用，可能是通过降低凋亡蛋白表达来发挥保护NSC、促进NSC 增殖的作用。与对照组比较，Aβ 组Tuj-1、GFAP 比例明显减少（P ＜0.01）；姜黄素组Tuj-1明显升高，GFAP 明显降低（P ＜0.05）；与Aβ 组比较，观察组Tuj-1、GFAP 明显增加（P ＜0.01），但明显低于对照组（P ＜0.05），提示Aβ 组NSC向神经元、星形胶质细胞分化比例均减少，姜黄素组NSC 向神经元分化，减少星形胶质细胞分化比例；观察组神经元分化Aβ 组增加，但低于对照组。

综述所述，姜黄素可促进NSC 增殖，促进NSC向神经元分化，逆转Aβ 对NSC 的损伤可能是由于抑制了凋亡基因表达，为功能性神经元治疗Aβ 沉积所致神经损伤性疾病提供理论依据。