马铃薯茄镰孢菌干腐病生防菌株的筛选、鉴定及其防效

刘治会，郝蓉蓉，许永锋，杨成德，*，张俊莲

(1.甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省张掖市植保植检站，甘肃 张掖 734000； 3.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州730070)

马铃薯是重要的粮菜兼用型作物，也是优良的饲料作物，是仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物[1]。甘肃省是我国马铃薯主产区之一，干腐病是马铃薯贮藏期最常见的真菌性病害，严重影响马铃薯的经济价值和食用价值，常年发病率为10%～30%，最高达60%[2-4]。茄镰孢菌(Fusariumsolani)是甘肃省马铃薯干腐病优势病原菌。侵染块茎后，初期薯块表面出现黑褐色凹陷病斑，随后扩大形成较多轮纹状褶皱；后期薯块内部变空，干燥时内部长满白色菌丝，整个薯块变硬、变轻、干缩，呈灰褐色或深褐色，湿度大时发病部位变红呈糊状[5]。

目前，对马铃薯干腐病以化学防治为主，常用药剂有戊唑福美双、代森锰锌、戊唑醇、咯菌腈和噻菌灵等杀菌剂，控制效果较好，但容易诱导病原物产生耐药性、农药残留和环境污染等问题[6-7]。生物防治是指利用生物及其代谢所产生的产物来防治植物病虫害的一种方法，具有无毒、无害、无污染和不易产生耐药性等优点[8-9]。国内外众多实验室已经开始大量筛选、保存可以有效抑制植物病原的生防菌株[10-11]；王瑞霞等[12]分离得到对马铃薯环腐病菌(Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicum)具有较强拮抗作用的内生细菌P1；畅涛等[13]发现，莫海威芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)ZA1对马铃薯坏疽病菌具有明显的抑制作用，且对马铃薯贮藏期的多种病原具有较好的抑制作用；关小敏等[14]从马铃薯根际土壤中筛选获得能有效抑制马铃薯立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的菌株G1。我国对马铃薯干腐病的系统性研究及报道较多，对其在甘肃地区的发生、分布、流行和致病菌的种类等也有较多报道。但是，有关马铃薯干腐病生物防治方面的报道较少，仅陈书珍等[15]发现生物农药枯草芽孢杆菌B2对马铃薯窖藏干腐病具有较强的抑菌防病作用。因此，本试验以甘肃省马铃薯干腐病优势病原茄镰孢菌(F.solani)为指示菌，从120株内生细菌中筛选拮抗菌，并进行了防效试验，以期为甘肃省马铃薯干腐病的生物防治提供菌种资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病原菌：从甘肃省马铃薯上分离获得的干腐病原菌——茄镰孢菌QF-4(F.solani)。

供试拮抗细菌：262AG6、B3、YO-71、264ZY10、XSG3、G2、e、O10、261AG3、FQ1、S27、B6、G5、YO-57、264AY3、S21、O55、O56、O61、S26、b、Y0、d、261AY7、261AY2、262AY6、O50、O27、B3、O16、O22、ZMG1、ZMG3、261ZG8、263ZG9、262XG5、265ZY1、265ZY3、265XY6、263XY1、267GG1、267GG2、263ZG7、265ZG8、263XG9、262XG7、QL-1、B6、O44和S30等120株，以上菌株均由甘肃农业大学植物保护学院植物病原细菌及细菌多样性实验室提供。

培养基：PDA培养基、NA培养基、NB培养液，配方详见参考文献[16]。

供试药剂：70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(陕西美邦农药有限公司)；枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(德强生物股份有限公司)；265ZY1、265ZY3和265XY6的3种复配菌肥；30%噻呋·嘧菌酯悬浮剂(陕西上格之路生物科学有限公司)。

1.2 拮抗菌株的筛选

采用平板对峙法，以马铃薯干腐菌(F.solani)为指示菌，根据抑菌率筛选优良拮抗菌株。

抑菌率(%)=[(对照病原菌菌落直径-处理病原真菌菌落直径)/(对照病原菌菌落直径-菌饼直径)]×100。

1.3 拮抗菌株的鉴定

1.3.1 拮抗菌株的形态观察

将保存于斜面的拮抗菌株在NA平板上划线后置于28 ℃恒温箱中培养，72 h后观察菌落形态并描述培养性状及拍照。

将拮抗细菌分别划线接种于NA平板，培养18～24 h后进行革兰氏染色，镜检拍照[17]。

1.3.2 16S rDNA序列鉴定

DNA的提取。将活化24 h的菌株接入NB培养液，28 ℃振荡培养12 h，随后按上海生物工程技术有限公司试剂盒提取DNA。

PCR扩增。利用引物对提取的DNA进行PCR扩增，引物序列分别为5’-CCGGATCCAGAGTTTGATCATGGCTCAGCA-3’和5’-CGG GATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，由上海生物工程技术有限公司合成。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性10 s，54 ℃退火20 s，68 ℃延伸40 s，35个循环；最后在68 ℃下延伸7 min，4 ℃保存。反应结束后，取5 μL PCR扩增产物经电泳检测，具特异性条带的扩增产物送上海生物工程技术有限公司测序。

序列分析。将上海(Sangon)生物工程技术公司所测序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比较(http:∥www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)，选择同源性达99%以上的序列用Mega(7.0)软件中的邻接法构建系统发育树，确定各菌株的系统发育学地位。

1.4 大田试验对马铃薯干腐病的防效

试验在张掖市民乐县南古镇观音堂村进行，试验种薯为大西洋，种植时间为2017年5月6日。微生物菌剂采用草炭、有机肥、骨粉按45%、45%和10%混合作为发酵基质，充分混匀后装入布袋121 ℃高压灭菌2 h，按10%(265ZY1、265ZY3、265XY6按1∶1∶1混合)接种量接入种子液，于浅盘中置于28 ℃恒温培养箱中发酵10 d，后35 ℃烘干并称取1 g干燥的发酵菌剂采用平板稀释计数法计算活菌数(CFU·g-1)，菌量达1012CFU·g-1。

将马铃薯切为边长3～4 cm的小块，用3种菌复配剂(265ZY1、265ZY3、265XY6)3 kg·667m-2拌种处理，以30%噻呋·嘧菌酯悬浮剂设26.5 mL·667m-2、枯草芽孢杆菌可湿性粉剂设60 g·667m-2和70%甲基硫菌灵可湿性粉剂设132 g·667m-2作药剂对照，以清水为空白对照；每处理3次重复，每重复100个薯块，以播种形式将处理薯块埋于重茬马铃薯田中，30 d后调查薯块干腐病发生情况，并计算发病率、病情指数和防效[18]。

1.5 数据分析

采用Excel 2007、SPSS 24.0、Mega(7.0)等软件进行试验设计与数据处理。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的筛选

从120个供试内生细菌中，经初筛获得30株对茄镰孢菌有较好拮抗效果的菌株。复筛得到拮抗效果较强且稳定的菌株265ZY1、265ZY3和265XY6进行后续研究(表1)。

2.2 拮抗菌株的鉴定

2.2.1 形态及培养性状观察

经革兰氏染色，265ZY1、265ZY3和265XY6菌体均为紫色，即革兰氏阳性，菌体杆状(图1)；265ZY1菌落呈现白色、干燥、扁平、边缘整齐，表面有褶皱；265ZY3菌落较厚，边缘整齐表面干瘪多褶皱，呈不规则圆形，乳白色；265XY6乳白色半透明菌落，表面多褶皱，边缘不整齐(图2)。

2.2.2 16S rDNA 序列分析

利用试剂盒提取菌株265ZY1、265ZY3和265XY6的基因组DNA，在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，提取的DNA片段特异性良好，满足扩增要求，可以进行PCR扩增。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，与DL2000Marker比较，约在1 500 bp处有一明亮条带，其分子量大小与菌株16S rDNA基因序列长度的理论值相符，送上海生物工程技术有限公司测序。

表1 良好拮抗菌株的抑菌率

Table 1 The inhibition rate of antagonistic bacterial strains

菌种Strain抑菌率Inhibition ratio/%菌种Strain抑菌率Inhibition ratio/%菌种Strain抑菌率Inhibition ratio/%265ZY373.00O1071.88264AY371.25265XY672.80O2771.88S2171.15265ZY172.20261AG371.77O5571.04 262AG672.08FQ171.67O5671.04B372.08S2771.67O6170.94YO-7172.08O5071.46S2670.83264ZY1071.98B671.46b70.21XSG371.98G571.46263XY170.10e71.88YO-5771.25O4470.00G271.88QL-171.25S3070.00

图1 拮抗细菌的革兰氏染色Fig.1 Gram staining of antagonistic bacteria

图2 拮抗细菌的培养性状Fig.2 Culture characteristics of antagonistic bacteria

将所测序列提交至NCBI中的GenBank数据库，登录网址http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi， 用BLAST软件将菌株265ZY1、265ZY3和265XY6的16S rDNA序列与GenBank中序列进行比较，并下载同源性较高的序列，使用Mega(7.0)软件邻接法构建系统发育树(图3)，结果表明，菌株265ZY1与死谷芽孢杆菌B.vallismortis(KF818642)聚在一起，相似度达99%；菌株265ZY3与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens(KJ149810)聚在一起，相似度达99%；菌株265XY6与甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus(KM817258)聚在一起，相似度达99%。结合形态特征将菌株265ZY1鉴定为死谷芽孢杆菌B.vallismortis，菌株265ZY3鉴定为解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens，菌株265XY6鉴定为甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus。

2.3 对马铃薯干腐病的防效

由表2可知，施用4种药剂后，马铃薯干腐病的发病率为9.17%～20.00%，病情指数为1.76～6.02，空白对照的发病率和病情指数分别为59.17%和22.96，其中，三菌株(265ZY1、265ZY3、265XY6)复配菌剂的防效达79.75%，低于30%噻呋嘧菌酯(防效达92.25%)的防效，但优于70%甲基硫菌灵(防效达73.50%)，与枯草芽孢杆菌防效相似。结果表明，本试验所得微生物菌剂对马铃薯干腐病具有较好防效，说明微生物菌剂具有开发为生物农药的潜力。

3 讨论与结论

表2 四种药剂对马铃薯干腐病的防效

Table 2 Control effect of four fungicides on potato dry rot

药剂Fungicide用药量Dosage发病率Disease incidence/%病情指数Disease index防效Control effects/%甲基硫菌灵Thiophanate-methyl132 g·667m-220.00±0.03 b6.02±0.09 b73.50±0.04 c枯草芽孢杆菌Bucillus subtilis60 g·667m-215.83±0.02 bc4.45±0.61 bc80.75±0.03 b三菌株复配30000 g·667m-214.17±0.02 bc4.72±0.25 bc79.75±0.05 bCombination of three strains(265ZY1、265ZY3、265XY6)噻呋嘧菌酯Thiflufur azoxystrobin26.5 mL·667m-29.17±0.04 c1.76±0.10 c92.25±0.02 a对照Control—59.17±0.07 a22.96±0.70 a—

同列数据后没有相同字母表示在0.05水平差异显著(P<0.05)。

Values with different lowercase letter within the same column meant significant difference among different treatments at 0.05 level.

目前，对马铃薯干腐病防治主要依靠化学农药[19]，随着大量微生物农药的开发与应用，生物防治已成为一个热门的研究领域，发展至今，已经具有较为完整的理论体系和方法。近年来，由于生态环境与食品安全问题逐渐受到社会的关注，从而生物防治得到各方面的大力支持，且研究成果逐步从实验室走向田间，在农产品安全生产中越来越得到人们的重视。国外对马铃薯干腐病的生物防治已取得了较大进展[20]，但国内利用生防细菌防治马铃薯干腐病报道相对较少。马铃薯干腐病的生物防治首见于Schisler等[21]的报道，他们对威斯康星地区的马铃薯田间土壤的300多个细菌与酵母菌株进行筛选，发现有18株细菌对马铃薯干腐病具有一定防治潜力。Schisler等[22]在2000年报道了用拮抗细菌来防治贮藏期马铃薯干腐病，使贮藏期马铃薯干腐病发病率下降了35%～81%。本试验筛选获得3株对甘肃马铃薯干腐病菌具有良好抑制作用的菌株265ZY1、265ZY3和265XY6，其中265ZY1溶磷能力较强，达40 μg·mL-1，265ZY3、265XY6产IAA较强，分别达110和147 μg·mL-1，且三株细菌能两两亲和(另文报道)，为甘肃马铃薯干腐病生物防治提供了菌种资源和复配防效的依据。

芽孢杆菌是人类发现最早的拮抗细菌之一。具有分布广、抑菌谱广、抗性强、无毒等特点，在动植物的生物防治中应用比较广泛[23]。在农业生产中，芽孢杆菌作为生防细菌对多种病害有防治作用，张猛等[24]报道了死谷芽孢杆菌菌株wm005对油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、黄瓜立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearium)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.lycopersici)、水稻恶苗病菌(Fusariummoniliforme)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.niveum)表现出很强的抑制作用；张国漪等[25]研究发现，死谷芽孢杆菌HJ-5对棉花黄萎病(cottonvirticilliumwilt)有较好的防治作用；魏新燕等[26]研究发现，甲基营养型芽孢杆菌BH21具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的基因，该菌株脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)具有较强的拮抗作用；周登博等[27]在天然饼肥发酵液分离获得甲基营养型芽孢杆菌4-L-16，其对香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)、荔枝炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)等9种病原真菌具有抑菌活性。解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，这些代谢产物使得解淀粉芽孢杆菌能够具有广泛的抑制真菌和细菌的活性。潘虹余等[28]发现，解淀粉芽孢杆菌 B15发酵液对灰葡萄孢具有良好抑菌效果。这些研究表明芽孢杆菌已被广泛应用于生物防治；且芽孢杆菌在防病的稳定性、与化学农药的相容性等方面表现出极大地优势。因此，筛选经济、高效的生防芽孢杆菌对农业生物防治有极其重要的作用。

本试验结果表明，菌株265ZY1、265ZY3和265XY6经鉴定均为芽孢杆菌，且对马铃薯干腐病菌具有良好的抑菌效果，对马铃薯干腐病菌的抑菌率分别为72.20%、73.00%和72.80%；对3菌株复配菌剂进行了模拟大田试验，其防治马铃薯干腐病的防效达79.75%，表明本试验筛选和鉴定的3株芽孢杆菌具有防治马铃薯干腐病的能力。