四川石渠县牦牛源蜱感染巴尔通体的分子流行病学调查

唐天才，刘城成，袁东波，郭 莉，侯 巍，莫 茜，阳爱国，郝力力，*，李 锐

(1.西南民族大学 生命科学与技术学院，四川 成都 610041； 2.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都，610041；3. 浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州310021)

巴尔通体(Bartonella)是一类广泛寄生于脊椎动物红细胞内的革兰氏阴性菌，可引起严重的人兽共患病，如人类卡里翁病(Carion’s disease)、战壕热(trench fever)、猫爪病(cat-sratch disease，CSD)等[1]，是近年来我国新发传染病之一，具有重要的公共卫生学意义。巴尔通体可广泛存在于自然界的动物体内，包括犬、猫、兔、牛、鼠，及一些野生动物等，并经蜱、蚤、白蛉等吸血节肢动物传播。近年来，国内外对人、啮齿动物，以及蜱巴尔通体感染情况进行了相关调查。美国、法国、秘鲁、荷兰采用PCR方法对蜱、蚤体内巴尔通体进行了检测[2-3]；意大利、日本、菲律宾等国家对猫巴尔通体感染情况进行了调查[4]；福建[5]、浙江[6]、黑龙江[7]、云南[8]等省区对蜱、鼠形动物的巴尔通体感染情况进行了一系列调查。石渠县位于四川西北部的纯牧业县，境内平均海拔4 200 m，牦牛是当地最重要和数量最多的家畜，整体养殖方式粗放，驱虫意识淡薄，更重要的是牧民与牦牛接触极其紧密，极易被寄生于牦牛体表的蜱叮咬继而感染相关蜱媒病。到目前为止，尚无石渠县境内巴尔通体的相关报道。因此，本研究以石渠县牦牛体表的蜱为研究对象开展调查，以期初步了解当地牦牛体表寄生蜱的种类及其巴尔通体的感染情况，为该地区蜱传巴尔通体病的防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 蜱采集

于2018年3至8月从石渠县麻甲乡、德荣马乡、阿日扎乡和长须干玛乡的牦牛体表采集蜱(每个乡选择2～3个村，每村选择2～3家农户的牦牛群，每头牦牛体表采集5～6只，此法采集相对更能保证样本的代表性和真实性)，装入收集管，塞入潮湿脱脂棉，形态分类后放入75%乙醇溶液中，并置于4 ℃冰箱保存待检。

1.1.2 主要试剂

组织基因组DNA提取试剂盒(EasyPure Genomic DNA Kit)；Trans 2K Plus DNA marker、2× EasyTaqPCR SuperMix(北京全式金公司)，1×TAE溶液，琼脂糖。引物合成、测序均由生工生物工程技术服务有限公司(成都公司)完成。

1.1.3 主要器材

电泳仪电源(北京六一仪器厂，DYY-6C型)、Leica S9D体视显微镜、台式高速离心机(eppendorf 5402型)、Bio-Rad伯乐梯度PCR扩增仪(PTC240型)和Bertin Precellys 24研磨器等。

1.2 方法

1.2.1 蜱形态分类

根据文献[9]和[10]，采用体视显微镜对蜱初步进行形态学鉴定，鉴定后选取每个地点不同种类蜱的20%进行分子生物学鉴定，最终确定种类。

1.2.2 DNA提取

取出用75%乙醇保存的样品，无菌水洗涤晾干后沿纵向中轴线切割，分别装入EP管，半只于-80 ℃冰箱冻存，另外半只加入500 μL无菌水于Bertin Precellys 24研磨器充分研磨，参数如下：每管加入陶瓷珠(直径0.5 mm的20珠和2 mm的5珠)，5 500g研磨2次；4 000g研磨1次。取研磨液200 μL，用EasyPure Genomic DNA Kit按照说明书提取DNA，于-20 ℃保存备用。

1.2.3 PCR检测

蜱和巴尔通体的分子鉴定分别采用Ondrejicka等[11]和Reis等[12]建立的方法，引物见表1。2种引物扩增均采用25 μL的反应体系：2× EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，模板1 μL、ddH2O 9.5 μL，混匀。设阳性对照(B.melophagiDNA由本实验室保存)和阴性对照(去离子水)。蜱COⅠ基因扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸55 s，40个循环；72 ℃延伸8 min；16 ℃保温。巴尔通体gltA基因扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃延伸8 min；16 ℃保温。取2 μL PCR扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中100 V电泳30 min，凝胶成像仪中观察结果。

1.2.4 序列分析和统计分析

阳性样品送生工生物工程技术服务有限公司(成都公司)测序，所得序列用DNA Star软件进行拼接分析，在NCBI中BLAST进行比对，再应用MEGA 6.0软件以Neighbor-Joining法(bootstrap值1 000)构建系统进化树，并用SPSS软件对数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 蜱采集数量与形态鉴定

4个乡共采集到蜱818只，分别是长须干玛乡234只、麻甲乡224只、德荣玛乡192只、阿日扎乡168只。经鉴定，青海血蜱172只，西藏革蜱646只，形态特征分别如图1、图2所示。

2.2 蜱分子鉴定

2.2.1 蜱COⅠ基因扩增

表1 PCR引物

Table 1 PCR primers

鉴定物种Species引物序列Primer sequence(5'-3')靶基因Gene产物大小Product/bp参考文献References蜱TickLCO1490: GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGCOⅠ658[11]HCO2198: TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA巴尔通体Bart781: GGGGACCAGCTCATGGTGGgltA356[12]Bartonella sppBart1137: AATGCAAAAAGAACAGTAAACA

A，青海血蜱背面；B，青海血蜱腹面。A， Dorsal surface of Haemaphysalis qinghaiensis; B， Ventral surface of Haemaphysalis qinghaiensisi.图1 青海血蜱形态特征Fig.1 Morphological characteristics of Haemaphysalis qinghaiensis

A，西藏革蜱背面；B，西藏革蜱腹面。A， Dorsal surface of Dermacentor everestianus; B， Ventral surface of Dermacentor everestianus.图2 西藏革蜱形态特征Fig.2 Morphological characteristics of Dermacentor everestianus

以提取的蜱组织DNA为模板，扩增蜱COⅠ基因片段，均出现目的条带，部分样本电泳如图3所示，片段大小约658 bp，与预期相符。

2.2.2 蜱COⅠ基因遗传进化分析

蜱COⅠ基因序列经拼接、比对后共得5条，其中4条属于西藏革蜱，1条属于青海血蜱，分别命名为D.everestianus. shiqu1-4、H.qinghaiensis. shiqu。选取Blast比对后同源性最高的序列1～2条以确定种，即青海血蜱和西藏革蜱，再选取不同地点分离到的青海血蜱和西藏革蜱的COⅠ序列，最后选取部分不同种类的血蜱和革蜱的COⅠ序列作为参考序列，构建进化树。如图4所示，4个革蜱分离株和西藏革蜱(KJ396938)亲缘关系最近，同源性达98.0%～99.5%。血蜱分离株则与甘肃天祝(MF981066)、甘肃临洮(MF981034)分离的青海血蜱亲缘关系最近，同源性达99.09%；与青海湟源(MF981069)、甘肃永靖(MF982056)分离的青海血蜱同源性分别达98.63%、98.48%。

2.3 巴尔通体gltA基因PCR扩增

以提取的蜱组织DNA为模板，扩增巴尔通体gltA基因片段，麻甲乡部分样本电泳如图5所示，片段大小约356 bp，与预期相符。

2.4 巴尔通体PCR检测结果

巴尔通体检测结果如表2所示，在818只蜱中，有246只检测到巴尔通体，感染率为30.07%(246/818)。其中，麻甲乡感染率最高，达76.79%，其余依次是长须干玛乡17.95%、德荣玛乡12.50%、阿日扎乡4.76%。经χ2检验，麻甲乡的感染率显著(P<0.05)高于其他3个地方。另外，只在麻甲乡采集到2种蜱。

M，DL 2 000 marker；1，阳性对照；2～8，蜱样本；9，阴性对照。M， DL 2 000 marker; 1， Positive control; 2-8， Tick samples; 9， Negative control.图3 麻甲乡部分蜱COⅠ基因PCR产物电泳图Fig.3 PCR products of COⅠ gene of tick samples

图4 基于COⅠ基因蜱种系统进化树分析Fig.4 Phylogenetic analysis of ticks based on COⅠ gene

M，DL 2 000 marker；1，阳性对照；2～9，蜱样本；10，阴性对照。M， DL 2 000 marker; 1， Positive control; 2-9， Tick samples; 10， Negative control.图5 麻甲乡部分巴尔通体gltA基因PCR产物电泳图Fig.5 PCR products of gltA gene of some samples in Maga village

2.5 巴尔通体gltA基因遗传进化分析

巴尔通体gltA基因序列拼接、比对后共得3条，分别命名为UnculturedBartonellasp. Shiqu 1-3，其中UnculturedBartonellasp. shiqu1与unculturedBartonellasp.shiqu 2仅1个碱基的差异，与UnculturedBartonellasp. shiqu 3有34个碱基的差异。选取Blast比对后同源性最高的序列1～2条，以及不同种类巴尔通体的gltA基因序列等16条作为参考序列，构建进化树，进行种系发育关系分析。如图6所示，UnculturedBartonellasp. shiqu1和UnculturedBartonellasp. shiqu 2与美国的Bartonellamelophagi(AY724768)序列同源性分别达100%和99.7%，与我国新疆未定种的UnculturedBartonellasp.xinjiang (KY224150)同源性分别达100%和99.7%。UnculturedBartonellasp. shiqu 3与未定种的Bartonellasp. RF124HAIN(FJ464240)序列最接近，同源性达98%，与台湾分离的Bartonellagrahamii(GU056195)同源性达95%。

表2 石渠县蜱巴尔通体PCR检测结果

Table 2 Detection results of ticks-borneBartonellain Shiqu County

调查点Location样本数Number of samples青海血蜱H. qinghaien-sis西藏革蜱D. everestianus合计Total阳性数Number of postive samples青海血蜱H. qinghaien-sis西藏革蜱D. everestianus合计Total感染率Infection rate/%青海血蜱H. qinghaien-sis西藏革蜱D. everestia-nus合计Total阿日扎Arizha016816808804.764.76麻甲Maga172522241363617279.0769.2376.79*德荣玛019219202424012.5012.50Derongma长须干玛023423404242017.9517.95Changxugan-ma 合计Total17264681813611024679.07*17.0330.07

*表示差异显著(P<0.05)。

* represented the significant difference(P<0.05).

图6 基于gltA基因巴尔通体系统进化树分析Fig.6 Phylogenetic tree of Bartonella based on the gltA gene

3 讨论

蜱的发育过程分卵、幼蜱、若蜱、成蜱4个时期，属不完全变态发育，在每个时期形态特征不同，而相近物种之间形态特征又相似，所以仅从形态学鉴定需要丰富的经验，难度较大。目前，COⅠ基因是DNA条形码基因之一，能够在种的水平对物种进行鉴定[11，13]。因此，形态学与分子生物学相结合的方法已广泛应用于蜱的鉴定，如Casati等[14]通过COⅠ基因鉴别了澳大利亚的具角硬蜱与全环硬蜱，吕继洲等[15]通过COⅠ基因鉴定了新疆的草原革蜱和边缘革蜱。本研究鉴定出2种蜱，即青海血蜱和西藏革蜱，这可能与采集方法和宿主有关，原因包括：1)蜱生活史中90%以上处于非寄生阶段，多栖息于草原、森林等生境；2)单宿主蜱发育阶段均在一个宿主体表，如微小牛蜱；3)二宿主和三宿主蜱每一发育阶段饱血后均脱落，下一阶段重新寻找宿主[16]，如青海血蜱、西藏革蜱。本试验仅从牦牛体表采集，后期可采用布旗法或者加大宿主种类，从马、高原鼠兔、高原鼢鼠等体表采集，从而更系统、更全面、更深入的研究石渠县蜱的种类和分布。此外，青海血蜱只在麻甲乡采集到，这可能与蜱的生活特性、海拔有关。每种蜱都有特定的生存环境，包括海拔、植被类型等，如西藏革蜱仅生存于3 500～4 500 m的高海拔地区，而青海血蜱分布在海拔2 000～4 200 m的地区[16]。就地理位置而言，麻甲乡位于金沙江河谷寒温带半农牧区，海拔在3 300～3 800 m，而其他3个乡位于雅砻江流域亚寒带纯牧区，海拔在4 300～4 600 m，两区的海拔高度存在明显的差异，这很可能是只在麻甲乡发现青海血蜱的主要原因。

巴尔通体是一种地理分布广泛，宿主动物种类繁多，可通过蜱、蚤等节肢动物传播的人兽共患病原体。gltA基因为巴尔通体的遗传学分类标志[6]，在国内外已被广泛应用于巴尔通体的诊断和研究。如美国[2]、荷兰[3]等均有报道从太平洋硬蜱(Ixodespacificus)和篦子硬蜱(Ixodesricinus)等蜱中扩增出巴尔通体的gltA基因，其感染率分别为19.2%(29/151)和60.0%(73/121)；孙继民等[6]从浙江省中华硬蜱中扩增出巴尔通体的gltA基因，其感染率为16.3%(14/86)。本试验共采集到818只蜱，其中有246只检测到巴尔通体，感染率为30.07%。值得注意的是，只有在麻甲乡采集到2种蜱，且青海血蜱的感染率(79.07%)高于西藏革蜱(69.23%)，其主要原因可能是蜱的种类不同。据报道，某些蜱是一些特定病原的携带者，如青海血蜱是羊泰勒虫的主要传播媒介[17]；网纹革蜱(D.reticulatus)更容易携带劳氏立克次体，而边缘革蜱(D.marginatus)更容易感染斯洛伐克立克次体[18]。本试验中，相对于西藏革蜱而言，青海血蜱是否为携带巴尔通体的优势蜱还需进一步研究。另外，不同地点的感染率存在差异(P<0.05)，其中，麻甲乡的总感染率为76.79%，显著高于其他3个地方，这可能与麻甲乡相对较低的海拔和舒适的气候有关。

至今证实有B.grahamii、B.melophagi、B.henselae、B.elizabethae等15种巴尔通体可导致人类疾病[19]。有报道从人的血液中通过PCR方法检测到B.melophagi[20]，同样也从以色列的牛血中检测到B.melophagi[21]。鉴于此，后期可扩大调查对象，对牦牛血进行检测，从而深入了解石渠县巴尔通体的流行情况。遗传进化分析显示，本试验中共检测到2种巴尔通体，一种与B.melophagi亲缘关系最近，另一种则与未定种的Bartonellaspp. RF124HAIN和B.grahamii遗传关系最接近。

综上所述，本试验首次对石渠县牦牛源蜱中巴尔通体的感染情况进行了调查，蜱较高的感染率提示当地居民存在感染巴尔通体的风险，后期应进一步加强巴尔通体流行情况的监测，为当地巴尔通体的研究和防控提供数据支持。