蛋白质互作技术研究进展

卢艳艳 王超 侍福梅

摘要：蛋白质作为细胞活性及功能的执行者，以复杂有序的动态互作协调着细胞的增殖与分化、衰老与死亡以及环境应答等各种重要生理过程。重点介绍了酵母双杂交系统、双分子荧光互补、噬菌体展示技术、荧光共振能量转移技术、谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白沉降技术、免疫共沉淀技术等蛋白质互作研究技术的原理及在生物学中的应用，以及生物信息学在蛋白质互作研究中的应用，并对目前及未来蛋白质互作技术的发展方向进行了探讨。

关键词：蛋白质;生物信息;蛋白质互作

中图分类号：Q51         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）12-0005-06

Abstract： Proteins，the true executer of cell activities and functions， play important roles in the proliferation， differentiation， aging and death， and environmental response via complex and highly ordered dynamic interaction. The basic principles and applications of several related research techniques in protein-protein interactions， including yeast two-hybrid system， bimolecular fluorescence complementation assay， phage display technology， fluoresence energy transfer， GST Pull-down， co-immunoprecipitation， and bioinformatics in protein interaction research applications， and their development prospects were also prospected.

Key words： protein; bioinformatics; protein interaction

2003年4月，人類基因组测序的完成，标志着生命科学正式进入后基因组时代，生命科学从单纯研究基因序列信息转向对基因功能的深入解析，蛋白质组学成为研究热点。蛋白质不能单独发挥作用，需依靠蛋白质与蛋白质之间的相互作用发挥功能。蛋白质与蛋白质之间相互作用即蛋白质互作（Protein-protein interaction，PPI）是细胞生化反应网络的一个重要组成部分，在新蛋白质及相关蛋白质复合物的发现、鉴定与功能验证，以及细胞信号转导、细胞代谢等研究方面发挥了关键作用，成为蛋白质组学研究的重要区域。通过PPI发现，当细胞凋亡发生时不同的热激蛋白质家族成员都广泛参与凋亡信号通路[1];线粒体抗病毒信号蛋白质（MAVS）作为一种接头蛋白质在调节宿主天然免疫信号通路过程中扮演着重要角色[2]。

蛋白质本身是多种多样的，每种蛋白质的独特生理属性影响着蛋白质间的相互作用，在体外试验分析重组蛋白质的表达，会导致机体内内含物的形成从而妨碍其功能的实现[3]。蛋白质间的互作也存在不同层次的复杂性，如：多亚基酶的纳米机制[4]、分子伴侣与靶蛋白质的互作[5]、蛋白质激酶与靶蛋白质互作[6]、代谢网络中多种蛋白质的互作[7]。因此，完全精准解读蛋白质的相互作用原理及功能，需要更加高效科学的PPI技术。

1  蛋白质互作技术

随着生物技术的不断发展，PPI技术得到了极大改善，试验过程变得简化，试验结果更加准确。目前PPI技术主要包括酵母双杂交（Yeast Two-hybrid）系统、双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation Assay，BiFC）、噬菌体展示技术（Phage Display Technology，PDT）、荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）技术、胱甘肽巯基转移酶融合蛋白沉降（Glutathione S-transferase Pull-down Assay，GST Pull-down Assay）技术、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）技术和Far-western blotting等多种研究PPI的技术。

1.1  酵母双杂交系统

酵母双杂交是1989年由Fields等[8]首次应用在真核生物酵母转录因子GAL4特性的研究中。酵母双杂交技术是建立在模式生物酵母之上，原理是酵母细胞起始基因转录需要有转录激活因子的参与，其在结构上是组件式的，有2个特殊的结构域：DNA结合结构域（DNA Binding Domain，DNA-BD）[9]和转录激活结构域（Transcription Activation Domain，AD）[10]，DNA-BD和AD单独存在没有转录激活功能。将2个蛋白质基因分别连接到BD与AD区域，若它们在空间上无限接近，则会形成复合物，转录激活因子恢复活性，功能激活，BD区域可识别酵母转录激活因子上游激活序列（Upstream Activation Sequence，UAS），转录产物激活UAS下游的报告基因使之转录[11]，根据报告基因的表达与否可以判断PPI的结果，进而测得未知蛋白质的功能。

酵母双杂交系统对蛋白质之间的微弱、瞬间作用敏感度较高，因此在许多生物学研究领域得到广泛应用[8，12]。李明智等[13]利用酵母双杂交系统筛选水稻组蛋白质去乙酰化酶HDA705的互作蛋白质，为进一步揭示HDA705的生物学功能提供了关键线索;Silva等[14]利用酵母双杂交技术验证了磷蛋白质与磷酸酶1之间的相互作用;陈泽良等[15]应用酵母双杂交技术初步筛选出与埃博拉病毒VP24、VP35、VP40相互作用的宿主蛋白质，并完成了初步功能分析。

酵母双杂交系统是研究蛋白质互作的所有方法中较为简便、灵敏和高效的一种方法[16]，但仍存在一些局限性。传统的酵母双杂交只能检测发生于核内的相互作用[17];在试验中，经常遇到假阳性，并且其转化效率不高，仍需进一步优化。目前，酵母双杂交系统衍生出了单杂交系统、三杂交系统、核外双杂交系统、反向双杂交系统、哺乳动物双杂交系统等技术[18]，未来酵母双杂交系统在生物学研究领域尤其是生物医药领域中的应用将更加深入。

1.2  双分子荧光互补

双分子荧光互补（BiFC）是在2002年由Hu等[19]提出的一种观察植物活细胞间PPI的方法。BiFC是基于两段不完整的荧光报告蛋白质互补片段重新结合成完整的报告蛋白质，并发出荧光的过程。该试验为观察活细胞中蛋白质间的相互作用和修饰提供了一种有效的方法。

BiFC技术的原理是利用荧光蛋白质基因的某些特定位点，将其切成2个不具荧光活性的N-端和C-端2个片段，使2个片段分别与目标蛋白质基因连接，构建重组表达载体，然后转染细胞融合表达，如果2个目标蛋白质存在相互作用，便能够相互接近，重新形成具用荧光活性的蛋白质，从而发射荧光，反之，目标蛋白质之间则没有相互作用。

自从Ghosh等[20]报道了绿色荧光蛋白质（Green Fluorescent Protein，GFP）通过N-末端和C-末端的重新组装产生绿色荧光以来，BiFC技术得到很大的改进和发展。例如，多色荧光互补技术（Multicolor）能够研究多种蛋白质间的相互作用。随着BiFC技术的完善，在生物学研究中的应用逐渐增多。曹建美[21]利用BiFC解析了玉米MAPK5与bZIP72蛋白质之间的相互作用;刘文晓等[22]在活细胞中通过BiFC直接观察研究MICOS复合物中各组成蛋白质之间的相互作用关系;Chen等[23]通过BiFC检测了HIV-1与辅助因子蛋白质以及上皮衍生生长因子之间的相互作用，其相互作用显著，这项研究提供了新的蛋白质生理条件下的成像系统，并为抵抗HIV病毒的蛋白质抑制剂类药物研发提供信息。到目前为止，已经有超过10种BiFC分析技术的荧光蛋白被发现。在活细胞Ca2+依赖蛋白质互作的研究中，黄色荧光蛋白质（Yellow Fluorescent Protein，YFP）的有效性首次被证明[24]，红色荧光蛋白质DsRed[25]被发现后关注较多，因为DsRed的应用延长了BiFC分析的波长范围。

在一般情况下，BiFC技术相比其他PPI分析荧光互补试验具有几个独特的优势[26，27]：BiFC可以研究未知结构信息的蛋白质间的相互作用，几乎可以对任何需氧生物通过基因改造表达融合蛋白质。BiFC复合物发射的荧光可以利用荧光显微镜、流式细胞分析仪等检测，不需要精密仪器、数据处理和利用试剂把融合蛋白分开。完整细胞的研究避免了在細胞分解过程中发生PPI的变化以及不同细胞隔室内容物的混合，既可对单个细胞中的PPI进行观察，也可以对不同细胞中不同细胞过程的差异进行研究。但是该技术也存在局限性，受到荧光基团形成时间和荧光蛋白复合物稳定性的限制。

1.3  噬菌体展示技术

噬菌体展示技术（PDT）最早是Smith[28]在1985年提出的，用丝状噬菌体作为载体进行分子生物学研究，并首次介绍了PDT。PDT是以噬菌体作为载体，利用基因工程技术将外源DNA片段连接到载体上，使外源DNA随噬菌体衣壳蛋白质结构基因一起表达，形成融合表达蛋白质，展示在噬菌体表面的一项分子生物学技术。

PDT是通过外源基因与噬菌体结构基因融合表达（不影响结构基因的活性），形成具有相对空间结构和生物活性的融合蛋白质，展示在噬菌体表面，利用靶标蛋白质，通过生物淘选的方法，使与靶标蛋白质特异结合的噬菌体被筛选出，然后利用筛选的噬菌体侵染大肠杆菌进行扩增，再进行序列测定分析，获得目的蛋白的功能信息，为下一步研究提供理论依据。

噬菌体技术广泛应用于验证PPI、临床应用[29]，抗体工程分离技术[30]，疫苗开发[31]等方面。目前的PDT包含各种噬菌体的载体，包括M13、T7、T4和f1。而近几年的有关报道也充分证明了噬菌体展示技术的广泛应用：利用噬菌体表面展示技术从人肝癌T7 cDNA文库中筛选出能与人CD8～+T淋巴细胞特异结合的蛋白分子[32];通过PDT技术制备出来的流感病毒、蛇毒等的特异性中和抗体[33];利用T7噬菌体展示技术筛选与人肠道病毒71型3A蛋白相互作用的蛋白质[34];运用PDT筛选到了可用于多菌型麻风病患者及潜在患者诊断的3段多肽[35]等。尽管PDT成本低、操作简单，但也存在一定的局限性，如噬菌体库容量和分子多样性有一定的限制，且文库一旦建成，很难突变和重组，因而文库中分子遗传多样性受到限制，细胞内有毒分子很难得到表达。

1.4  荧光共振能量转移技术

1948年由F？觟rster等[36]提出了荧光共振能量转移这一理论，与GFP的应用和改造使FRET技术得以在活细胞中广泛应用。1992年Prasher等[37]首次从维多利亚水母中分离并克隆了一种荧光物质——GFP，后来，更多的荧光蛋白（CFP、BFP、YFP等）被发现，为FRET的实现提供了基础。FRET是一种非辐射的能量转移，可以定时、定量、定位、动态地观察活细胞内蛋白质与蛋白质之间的相互作用[38]。

以最常用的CFP、YFP为例，简单介绍FRET原理。CFP发射光谱与YFP的吸收光谱存在重叠，两者距离足够近时，CFP的吸收波长激发，CFP的发光基团把能量共振转移到YFP的发光基团，CFP因此发射的荧光减弱（消失），YFP发射荧光，2个荧光基团能量转移对空间位置的变化感应非常灵敏。若要研究A、B蛋白间的相互作用，可以依据FRET的原理构建融合蛋白质系统，该系统包括CFP、B蛋白质、YFP。当A、B蛋白存在互作时，CFP和YFP在空间上足够接近而发生能量转移，YFP发射荧光，反之，则CFP发射荧光。

FRET技术在细胞生理研究、免疫分析和蛋白质组学研究中的应用有许多成功的报道。曹薇薇等[39]研究发现，通过FRET技术在活细胞生理状态下，可以实时动态监测TGF-β1/Smad3信号转导通路的过程;Mizutani等[40]首次将依据FRET原理设计的可检测BCR-ABL激酶活性的基因编码生物传感器应用于临床;FRET技术也陆续用于一些肿瘤药物的研发，如胰腺癌[41]、乳腺癌[42]等的抗癌药物。FRET技术具有分析速度快、方法灵敏度高、选择性好、无污染或污染小等优点，使其在包括细胞生理研究和蛋白质组学研究及临床相关的药物分析等领域应用日益广泛[43-46]。

1.5  GST Pull-down技術

1988年，Smith等[47]利用谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione S Transferase，GST）融合标签从细菌中进一步纯化出GST融合蛋白质。GST Pull-down是一个行之有效的体外验证PPI关系的试验技术，其既可以验证已知蛋白质的相互作用，还可以筛选与已知蛋白质互作的未知蛋白质，现已经广泛用于分子生物学领域[48]。

GST Pull-down的原理是通过利用基因工程技术将目的蛋白质基因与GST基因融合表达产生诱饵蛋白质，将该诱饵蛋白质溶液通过带有GTH（Glutathione）的层析柱，诱饵蛋白质与GTH结合，然后将待测蛋白质溶液过柱使它们反应，再用洗脱液洗脱，如果目的蛋白质与待测蛋白质间不存在互作，则开始时便被清洗出来，反之，则用洗脱液才能得到待测蛋白质。GST Pull-down的应用范围也很广泛。朱彤等[49]通过GST Pull-down验证植物体内NRP（具有响应胁迫并会引起细胞凋亡的一个蛋白质）与Fy PP3（一种PP6型的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶）之间具有相互作用。Luo等[50]对GST Pull-down技术进行了优化改进，使该技术的应用更加简便快捷。GST Pull-down技术与其他蛋白质互作技术的结合使用，试验结果会更加准确可信，Tran等[51]运用GST Pull-down技术、双向凝胶电泳和质谱分析法完成了DNA结合蛋白质的鉴定。

GST Pull-down技术方法简单易行、操作方便。缺点是无法大规模筛选蛋白质间的相互作用，且有些内源性蛋白质会干扰试验导致假阳性结果。相信在未来GST Pull-down技术与其他PPI技术的联合使用验证蛋白质之间的相互作用将会发挥更大的作用。

1.6  免疫共沉淀技术

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种研究特定蛋白质之间相互作用的理想方法，其可以确定活细胞内蛋白质的相互作用。该方法依靠抗原与抗体特异性结合原理鉴定蛋白质间的相互作用。

Co-IP技术的原理是细胞在温和、非变性条件下裂解时，细胞内许多完整的蛋白质-蛋白质间的相互作用保留了下来，随后加入与目标蛋白质对应的抗体使之发生免疫共沉淀反应形成抗原-抗体复合物沉淀，然后通过电泳分离、质谱鉴定，再对这些蛋白质复合物进行分析，以确定新的结合性伙伴、结合亲和力、结合动力学和目标蛋白质的功能。该技术既可以用来确定胞内蛋白质的结合，也可以用于发现新的蛋白质互作而形成的复合物。

目前，Co-IP技术在蛋白质互作方面的应用有了很大的发展。杨亮等[52]利用免疫共沉淀技术验证SET与eEF1A1在人肝细胞内的相互作用;Skieterska等[53]利用Co-IP技术鉴定了GPCR的二聚化作用;孙婷婷等[54]利用免疫共沉淀联合质谱分析方法，在人肝癌细胞系细胞株HepG2内筛选与肝细胞核因子（HNF）3β相互作用的蛋白质。Co-IP技术与其他PPI技术（如GST-Pull down、酵母双杂交系统等）相比具有其特有的优势，它可以鉴定活细胞内蛋白质间的自然结合，规避了外界因素，因此鉴定的蛋白质可信度高。Co-IP与其他PPI技术的联合使用可以有效提高试验的准确率。Co-IP技术也存在一定的局限性，如对低亲和力的蛋白质互作检测效率低、鉴定的蛋白质之间可能不是直接的互作、灵敏度受目标蛋白质浓度限制、抗体制备也比较复杂且昂贵等。

1.7  Far-western blotting

Far-western blotting是由Western blotting发展而来的研究PPI的一种技术。在Far-western中通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离目的蛋白质样品，固定到硝酸纤维素膜上，然后利用非抗体蛋白质来探测目标蛋白质[55]。Far-western blotting的原理是将样品蛋白质用非变性PAGE胶分离，将电泳后的蛋白质转膜，封闭膜、洗膜，加入待测蛋白质使其与膜上蛋白质相互作用，然后加入带有标记（如HRP）的待测蛋白质的抗体一同孵育，将膜和标记（如HRP）的底物一起孵育进行显色，分析试验结果。

近几年Far-western blotting技术得到不断改进完善，该技术被广泛应用。苏婧等[56]通过Far-western blotting从正常人肝组织中筛选出乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原PreS1结合蛋白质，为HBV的感染致病机理的阐述提供了理论依据;Li等[57]研究了在细菌黏附和侵入中起重要作用的层黏连蛋白质（LN）和纤连蛋白质（FN）间的相互作用。Machida等[58]使用GST标记的SH2结构域作为探针，检测在细胞信号传导磷酸化过程中与SH2结构域相互作用的蛋白质分子。Far-western blotting的优点是方法简便、快捷、灵敏度较高、假阳性低，在蛋白质组学中得到广泛应用;主要缺点是它至少需要一种一定量的纯化蛋白质，并且存在不可避免的非特异性合。

1.8  细胞骨架的蛋白质互作技术

细胞骨架的蛋白质互作技术（Cytoskeleton-based Assay for Protein-Protein Interaction，CAPPI）是2017年由美国加州大学戴维斯分校柳波教授团队开发的一种依赖于细胞骨架而研究PPI的新方法[59]，是利用细胞骨架的直观性，通过烟草叶片瞬时表达系统建立的一种技术，用于活体细胞生理环境中蛋白质互作的检测。CAPPI技术操作简单，不需要复杂的光学操作和计算过程，有望应用于更多的蛋白质类型。CAPPI技术在未来还有广阔的应用领域和提升空间，该技术的广泛应用及不断优化将有力地推动PPI研究的进展。

除上述介绍的一些蛋白质互作技术之外，还有等离子表面共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技术、蛋白质芯片（Protein Chip）技术、串联亲和层析（Tandem Affinity Purification，TAP）技术、细胞内共定位（Cellular Colocalization）技术等。

2  生物信息学（Bioinformatics）在蛋白质互作中的应用

生物信息学是20世纪80年代末开始，随着人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）的启动而兴起的一门新的学科[60]。此技术主要研究蛋白质、核酸等生物大分子[61]，是一门由生物学、化学、物理学、数学、信息科学和计算机科学等多学科交叉产生的新兴学科[62]，主要依赖于生物信息学数据库对海量的生物信息进行集中综合、管理、储存、分析和传播，利用计算机技术及软件处理发布，方便人们进行查询使用。

随着生物信息学的迅速兴起，生物信息学技术在蛋白质组学研究上的应用也越来越深入。研究人员将国内外的部分涉及蛋白质互作和生物信息学相关的蛋白质组数据库进行了整合[63，64]，生物信息学在蛋白质互作中应用的生命科学研究探索取得了显著成果。葛金涛等[65]利用生物信息学工具和方法对葡萄miR159家族成员进行分析，来研究葡萄miR159基因家族在葡萄生长发育过程中发挥的作用;李汉成等[66]检测甲基苯丙胺依赖大鼠和健康大鼠血清外泌体中微小RNA（miR）-181a-5p的表达，并对miR-181a-5p进行靶基因预测及相关生物信息学分析;路东晔等[67]对沙柳LAS基因RT-PCR技术成功克隆的SpsLAS基因进行生物信息学分析表明，沙柳LAS基因与番茄LS、拟南芥LAS等功能已确认的LS亚家族基因同源性较高，氨基酸相似性达50%以上，说明了LAS基因对于木生植物侧生分生组织同样有重要影响。

生物信息学主要特点是信息量大、数据更新快、内容复杂、传播途径网络化[68]。利用生物信息学探究PPI技术，实现信息共享，为今后更为全面、便捷﹑详尽地探索生命科学奠定了一定的信息化基础。

3  展望

近年来PPI研究发展迅速，其应用也愈加广泛，如在基因治疗中，可建立基因组蛋白质连锁图，确定多肽类药物的作用靶点[69]，针对一些疾病的治疗有了新的突破方向。当前的PPI技术存在一些假阳性干扰，对于正确认识蛋白质有一定影响，而且有些技术耗资大、耗时多、耗用人力大，对试验条件要求比较高，还不易得出准确的结果。每种技术都有各自的优缺点，有些可以优势互补，因此可以多种技术结合，优化体系，尽量减少干扰，进一步提高结果的準确性。针对具体的应用，优化整合互补不同PPI技术对解决当前存在的一些技术缺陷，进一步完善优化PPI技术具有很重要的意义。

结合生物信息学的优势进一步对目标蛋白质进行预测、建模等分析，同时辅助有效的蛋白质互作技术可以提高效率，节约成本，为蛋白质组学的发展贡献力量。

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收稿日期：2019-01-20

作者简介：卢艳艳（1991-），女，山东聊城人，在读硕士研究生，研究方向为模式植物细胞蛋白互作，（电话）17852267227（电子信箱）