linc00152通过调控DNMT3A和DNMT3B促进人宫颈癌细胞生长与侵袭

(广东省第二人民医院病理科，广东 广州 510317)

宫颈癌是女性最常见的癌症类型之一，特别是在发展中国家。此外，宫颈癌也是导致女性癌症死亡相关的第四大常见因素[1]。近年来宫颈癌的发病状态呈年轻化趋势，尽管早期癌症患者可通过手术与放疗等获益，但仍有部分患者预后不良，大多死于转移与复发。因此，阐明宫颈癌发生及转移的分子机制对促进新型治疗策略的发展至关重要。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸、有功能的非编码RNA。多项研究报道lncRNA参与细胞多方面生物学状态并且与肿瘤发展密切相关，但只有少部分lncRNA的功能特点和分子机制得到证实。其中，linc00152由828个核苷酸组成，位于2p11.2染色体。最初在肝癌中被发现具有差异低甲基化状态，并且被证实其通过多种机制来调节基因表达，包括表观遗传修饰[2]和lncRNA-miRNA[3]和lncRNA-蛋白质相互作用[2]。多项研究已表明，linc00152在多种恶性肿瘤中，如胃癌[4]、胆囊癌[5]、肾透明细胞癌[6]表达上调并发挥癌基因样作用。然而，linc00152在宫颈癌中的生物学功能及其机制尚不清楚。因此，linc00152在调控宫颈癌的发生、发展中的作用亟待研究。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人宫颈癌细胞株SiHa和HeLa细胞以及人正常宫颈上皮细胞株End1/E6E7细胞购于中国科学院细胞库，RNeasy Mini Kit购于Qiagen公司，Reverse Transcription Kit与SYBR Green染料购于Biorad公司，RNA抽提试剂盒购自美国Invitrogen公司。

引物序列：linc00152：5′-TTGATGGCTTGAACATTTGG-3′and5′-TCGTGA TTTTCGGTGTCTGT-3′；β-actin:：5′-TCACCAACTGGGACGACATG-3′and5′-GT C ACCGGAGTCCATCACGAT-3′，均由Qiagen公司合成，sh-linc00152、sh-control、si-DNMT3A、si-DNMT3B、si-control、Lipofectamine 2000、Transwell小室均购于美国Invitrogen公司，MTT购于美国Sigma公司，DNMT3A、DNMT3B和β-actin抗体以及二抗购于美国Santa Cruz公司。

1.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测linc00152的表达

培养SiHa、HeLa细胞以及End1/E6E7细胞，用RNA抽提试剂盒抽提三种细胞中的总RNA，再经逆转录试剂盒合成cDNA存于-70 ℃。qRT-PCR扩增反应体系包括2x QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix 10μL，10x miScript Universal Primer 2 μL，10x miScript Primer Assay2 μL，Template cDNA 1 μg，RNase-free water加至共20 μL。循环体系为：Cycle 1：37 ℃ 15 min，3个循环；Cycle 2：94 ℃ 5 sec，55℃ 5 sec，70 ℃ 5 sec，40个循环；Cycle 3：4 ℃ 5 sec，在CFX96实时荧光定量PCR系统上检测。以β-actin为内参，所测定的linc00152的相对表达量采用2-ΔΔCT法分析。

1.3 Western blot法检测linc00152对DNMT3A和DNMT3B蛋白表达的影响

培养HeLa细胞，将sh-linc00152和sh-control转染质粒按转染说明分别转染于HeLa细胞中，细胞分为sh-linc00152和sh-control两组，其中sh-control为对照组，转染后细胞继续培养48 h后收获细胞。RIPA裂解细胞并提取两组细胞总蛋白，用BCA法测定细胞的蛋白浓度，每组取等量样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后转膜，封闭1h，加入DNMT3A、DNMT3B抗体或β-actin抗体，4 ℃过夜，TBST洗膜，加二抗孵育1h，洗膜，ECL发光，X片曝光、显影、定影，扫描图片，并计算结果。

1.4 MTT实验

培养HeLa细胞，将sh-linc00152、sh-control、si-DNMT3A、si-DNMT3B以及si-control转染质粒按转染说明分别转染于HeLa细胞中。细胞分为sh-linc00152、sh-control、si-DNMT3A、si-DNMT3B以及si-control组，其中sh-control组为sh-linc00152组的对照组，si-control组为si-DNMT3A和si-DNMT3B组的对照组。分别取上述五组HeLa细胞接种于96孔板中，每组设5个复孔，培养至临近饱和，每孔加灭菌MTT液(5 mg/ml)20 μL，孵育4 h后取出，每孔中加入DMSO150 μL，低速振荡10 min，选择570nm波长在酶标仪上测定各孔吸光值，记录结果，实验重复3次。

1.5 Transwell侵袭实验

细胞培养与分组同MTT实验。在transwell小室中铺加8μL稀释好的基质胶，过夜形成基质膜。取100 μL即含1×105个细胞/ml的细胞稀释液，接种于transwell小室上层，下腔加500 μL含20%FBS的培养液后，置于37 ℃温箱中孵育36 h，取出，用棉签擦弃小室上层未迁移的细胞，PBS液轻洗，4%多聚甲醛固定、结晶祡染色下层穿出细胞，PBS液洗，倒置，晾干。光学显微镜下观察并摄相，随机选取4个高倍视野进行细胞计数，取平均值，实验重复3次。

1.6 统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。所有结果均以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，当P<0.05时，为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 宫颈癌细胞中linc00152表达水平

qRT-PCR检测结果显示，人宫颈癌细胞株SiHa和HeLa细胞中linc00152的表达水平分别为(1.633±0.086，1.926±0.107)，与正常宫颈上皮细胞株End1/E6E7细胞的表达水平(0.426±0.068)比较，差异具有统计学意义(P<0.01)(图1)。

图1 qRT-PCR检测linc00152的表达与End1/E6E7细胞相比，**P<0.01。

2.2 转染sh-linc00152、si-DNMT3A和si-DNMT3B后HeLa细胞中linc00152、DNMT3A和DNMT3B的表达

qRT-PCR检测结果显示，转染sh-linc00152组HeLa细胞中linc00152的表达水平明显低于sh-control组(图2)，差异具有统计学意义(P<0.01)；Western blot检测结果显示，转染si-DNMT3A、si-DNMT3B组HeLa细胞中DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平明显低于si-control组(图3)，差异具有统计学意义(P<0.01)。结果提示sh-linc00152、si-DNMT3A和si-DNMT3B均转染成功。

图2 Hela细胞中sh-linc00152表达与sh-control组相比，**P<0.01；

图3 Hela细胞中DNMT3A和DNMT3B蛋白表达

2.3 linc00152对DNMT3A和DNMT3B蛋白表达的影响

研究显示，DNMT3A和DNMT3B与宫颈癌的进展有关，且受非编码RNA的凋控。为明确在宫颈癌细胞中linc00152对DNMT3A和DNMT3B蛋白表达的影响，采用Western blot检测。结果显示，在HeLa细胞中，sh-linc00152组DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平明显低于sh-control组(图4)，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图4 DNMT3A和DNMT3B蛋白表达

2.4 linc00152对人宫颈癌细胞增殖的影响

MTT结果显示，在HeLa细胞中，sh-linc00152组、si-DNMT3A以及si-DNMT3B组HeLa细胞的OD值分别为(0.413±0.061，0.409±0.0531，0.407±0.048)，与sh-control组，si-control组相比(0.750±0.063，0.743±0.080)，差异均具有统计学意义(P<0.05，图5)。提示在HeLa细胞干扰linc00152、DNMT3A以及DNMT3B表达能抑制HeLa细胞的增殖。

图5 MTT法检测细胞增殖能力与sh-control组，si-control组相比，*P<0.05。

2.5 linc00152对人宫颈癌细胞侵袭的影响

Transwell结果显示，在HeLa细胞中，sh-linc00152组和si-DNMT3A以及si-DNMT3B组HeLa细胞穿过基质胶的细胞数量分别为(65±5)、(71±4)、(73±5)，与sh-control组，si-control组(115±7)、(126±6)相比，差异均具有统计学意义(P<0.01，图5)。提示在HeLa细胞干扰linc00152、DNMT3A以及DNMT3B表达能抑制HeLa细胞的侵袭。

3 讨 论

近年来，lncRNA在肿瘤发生、发展中的生物学功能及其分子机制已经成为研究热点。越来越多研究已经证实了lncRNA参与肿瘤的发生发展[7]，如肝癌[8]、胃癌[9]、尿路上皮癌[10-11]，并在恶性肿瘤中表达失调及功能异常。在体外研究中显示[12]，linc00152在胃癌细胞系中的表达明显高于正常胃粘膜上皮细胞，在胃癌细胞中敲低其表达可抑制细胞增殖和克隆形成，可促进G1期细胞周期停滞、触发晚期凋亡，抑制上皮细胞-间充质转化(EMT)与细胞的迁移与侵袭。研究表明[13]，在肝癌MHCC-97H细胞株中，linc00152的转录本主要存在细胞核中，且linc00152在体外可促进细胞增殖，在体内可促使肿瘤生长。此外，微阵列分析显示，linc00152通过与上皮细胞粘附分子(EpCAM)启动子结合可以激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径，从而调节肿瘤细胞的增殖、分裂以及肿瘤的发生。Cai等[5]证实，在胆囊癌中，linc00152明显促进癌细胞增殖、转移与抑制凋亡。Wu等[6]研究发现在肾癌细胞系中linc00152表达上调不仅能促进细胞增殖与侵袭，还能抑制G1期细胞周期阻滞并抑制细胞凋亡。本次研究通过采用qRT-PCR技术在宫颈癌细胞与正常宫颈细胞中检测发现，linc00152在宫颈癌细胞中的表达明显高于正常宫颈细胞，与上述研究相符。进一步通过MTT实验、Transwell实验研究发现，在宫颈癌细胞中敲低linc00152的表达能明显抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭，表明linc00152在宫颈癌中发挥癌基因样作用。

图6 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力与sh-control组，或si-control组相比，**P<0.01。

DNA甲基转移酶(DNMTs)是一类参与DNA甲基化的酶，通过影响DNA甲基化，在多种生命活动进程中发挥重要作用，如染色质结构的调控、X染色体的失活和基因组的稳定[14]。哺乳动物中DNA甲基转移酶家族可分为：DNA甲基化维持酶(DNMT1)以及DNA从头甲基化酶(DNMT3A和DNMT3B)。目前，随着对表观遗传学的深入研究，DNA甲基化在转录沉默和抑癌基因功能丢失中发挥重要作用[15]。无论基因组DNA过甲基化或去甲基化均可能导致抑癌基因的突变或改变其转录过程，进而引起细胞表型的改变。近年来，DNA异常甲基化与恶性肿瘤之间的相关性也引起了众多学者的关注，并获得了一些进展。研究证实DNA甲基转移酶(DNMT)在多种恶性肿瘤，如胃癌[16]、肝癌[17]、肺癌[18]中表达增加。DNMT3A和DNMT3B与宫颈癌的进展有关[19]。此外，非编码RNA在哺乳动物中调控DNA甲基转移酶的重要作用已被证实，同时已有相关调控机制的研究[20]。同样地，在本研究中，我们观察到在宫颈癌细胞中敲低linc00152可显著抑制DNMT3A和DNMT3B表达。本研究还观察到在宫颈癌细胞中敲低DNMT3A和DNMT3B后亦能抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭。

综上所述，linc00152在宫颈癌细胞中表达增高且抑制linc00152的表达，能够抑制宫颈癌细胞增殖与侵袭，其作用可能是通过调控DNMT3A和DNMT3B信号通路发挥的。这些结果为linc00152参与宫颈癌发生发展的可能分子机制提供了一个新的思路，linc0015也有望成为宫颈癌患者潜在的治疗靶点。