新疆石河子地区绵羊源胰阔盘吸虫的分离及分子鉴定

王正荣 ，张艳艳 ，徐雪萍 ，杨华 ，薄新文 *

（1.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆 石河子 832000；

2.省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆 石河子 832000）

胰阔盘吸虫是一种常寄生于水牛、骆驼、绵羊和山羊胰管，偶尔也寄生于胆管的一种吸虫，该虫种是寄生于反刍动物的优势阔盘属吸虫。胰阔盘吸虫的长期寄生会导致宿主胰管肥大，上皮增生，以及胰管周围组织的纤维化，进而引起胰阔盘吸虫病[1]。该病在世界上很多国家均有报道，虽然已经过多年的防控，但该病在一些地区的感染率依然较高，可达到47%-55%[2]。研究报道称胰阔盘吸虫的致病性相对较弱，但胰阔盘吸虫可能引起被感染动物生产性能的下降，包括体重减轻，产肉性能下降，以及最终导致死亡[3]。也有一些研究报道显示，由于某些特定群体的饮食习惯，胰阔盘吸虫偶尔也会感染人[4-5]。目前还没有商品化的用于预防胰阔盘吸虫病的疫苗，对该病主要采取药物防治方法，常用药物有吡喹酮或三氯苯咪唑等[6]。

新疆是畜牧业大省，牛羊养殖数量较大，且养殖方式呈现多样化，包括放牧、半舍饲和全舍饲等。在这种多种养殖模式并存的现状下，其寄生虫感染，尤其是胰阔盘吸虫感染情况如何，相关文献较少。因此，为了解笔者所在石河子地区绵羊胰阔盘吸虫的感染现状，我们采用常规形态学鉴定以及PCR聚合酶链反应分子鉴定方法，于2014年2月-2015年1月在石河子开展羊胰阔盘吸虫流行病学调查，调查结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验羊47只，其中42只来自石河子143团某个体羊场，3只来自石河子活畜市场，2只来自石河子141团。试验羊中有35只母羊，均为新疆军垦细毛羊杂交羊，12只公羊，2只为本地大尾羊，其余为本地土种羊与新疆军垦细毛羊杂交羊，2～5岁不等，冬季圈养，夏季在天山深处夏牧场放牧，春、秋两季在本地山间牧场放牧，于2014年3月25日前后，例行春季驱虫，所用药物为阿维菌素注射液，0.2 mg/kg体重。

1.2 试验方法

连续12个月，每月剖检绵羊3～4只。胰脏用剪刀沿胰管剪开，放水中漂洗，检查并挑出虫体，鉴定虫种。

1.3 胰阔盘吸虫的PCR鉴定

用通用型柱式基因组DNA提取试剂盒（康为世纪公司）提取虫体DNA，然后用于扩增阔盘属吸虫18S rRNA部分基因的PCR分析[7]；所有的PCR分析均包括阳性对照，同时采用高压灭菌去离子水为模板作为阴性对照。PCR 扩增条件如下：94°C预变性5 min，94°C变性35 s，55°C复性45 S，72°C延伸2 min，35个循环，72°C延伸10 min，所有PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙锭染色，紫外灯下检测。扩增引物如下，上游引物：5'-GGCTCATTAAATCAGCTATGGTT-3'，下游引物：5'-ACGACTTTTACTTCCTCTAAAT-3'。

1.4 数据处理

PCR扩增产物采用康为世纪公司快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化，纯化产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。采用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）软件将测序获得基因序列与genbank中的类似序列进行比较。然后，利用Mega 6.0软件构建以18S rRNA基因为基础的系统发育树，系统进化树的构建采用 neighbor-joining法，bootstrapped的值为1000，同时以大片吸虫18S rRNA基因作为进化树的外组。

2 结 果

2.1 胰阔盘吸虫的感染情况

被检的47只羊中有6只检出胰阔盘吸虫，感染率为12.77%，感染羊中仅一只羊感染强度较高，达300条，另外几只羊感染强度不高，分别感染1～25条不等。少量感染时胰脏未见明显病变。大量感染时，胰脏肿大，外观呈黑色条索状扭曲，质地变硬，胰管内壁充血、出血、增厚，周围肠系膜淋巴结肿胀，呈黑豆状，感染羊极度虚弱消瘦。

2.2 胰阔盘吸虫成虫形态学鉴定

活的胰阔盘吸虫为棕红色，固定后为灰白色。虫体扁平，较厚，呈长卵圆形，吸盘发达，口吸盘较腹吸盘大。咽小，食道短，肠支简单。睾丸2个，圆形或略分叶，左右排列在腹吸盘后。雄精囊呈长管状，位于腹吸盘前方与肠支之间。生殖孔开口于肠叉的后方。卵巢分叶3～6瓣，位于睾丸之后，体中线附近，受精囊成圆形，在卵巢附近。子宫弯曲，内充满棕色虫卵，位于虫体的后半部。卵黄腺呈颗粒状，位于虫体中部两侧，见图1。我们选取每只羊来源的虫体各一个，共计6个虫体，对其大小进行了测量，结果显示其大小为8.0～16 mm×5.0～5.8 mm。

图1 胰阔盘吸虫的虫体压片以及伊红染色图片

2.3 胰阔盘吸虫的PCR鉴定

本试验对采集的18个虫体进行了PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，扩增片段的大小为528 bp左右，与预期大小一致，见图2。

图2 18个胰阔盘吸虫的PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳检测

2.3 基于18S RNA部分序列的遗传进化分析（图3）

图3 石河子胰阔盘吸虫分离株遗传进化分析

本研究采用PCR方法扩增了18个吸虫的18S RNA基因的部分序列，最终选取其中6个虫体的18S RNA基因扩增序列进行测序及遗传进化分析，石河子分离虫株依次命名为SHZ-1，SHZ-2，SHZ-3，SHZ-4，SHZ-5以及 SHZ-6。同时我们以 Genbank数据库中的胰阔盘吸虫 （Eurytrema pancreaticum，NO.DQ401034.1）、 腔阔盘吸虫 （Eurytrema coelmaticum，NO.DQ401035.1）、 枝岐腔吸虫（Dicrocoelium dendriticum,NO.Y11236.1）、 东 方 岐 腔 吸 虫 （Dicrocoelium orientalis，NO.EF547131.1）、 窄 体 吸 虫（Lyperosomum collurionis，NO.AY222143.1）、双腔吸虫（Paraconcinnum leirsi，NO.JN831598.1）以及大片吸虫（Fasciola gigantica，NO.AJ004804.1）18S RNA基因为参照序列进行序列比对及进化分析。结果表明，石河子分离虫株与胰阔盘吸虫聚为一支，亲缘关系最近，与腔阔盘吸虫的亲缘关系次之。

3 讨 论

寄生性吸虫对全球人类以及动物的健康具有不可忽视的危害性，调查数据显示，全球有超过4 000万人感染食源性吸虫病，同时有超过10%的人群存在感染的风险。大多数吸虫病都流行于中低收入国家和地区[8]，其中阔盘属吸虫主要寄生于反刍动物的胰腺和胆管，该寄生虫病广泛流行于全球多个国家。尽管阔盘属吸虫病对人类和动物健康造成威胁，但该病仍然是被低估/忽视的吸虫病之一。检索CNKI数据库显示，胰阔盘吸虫病在我国大多数地区均有发生，寄生宿主涉及牛、绵羊、山羊、以及野生的山麂等，同时有两例胰阔盘吸虫感染人的研究报道[4-5]，说明该病在我国普遍存在，且已有感染人的报道，应给予足够重视。

本研究采用常规形态学鉴定和分子生物学方法对石河子地区绵羊胰阔盘吸虫的感染情况进行了调查研究。试验结果表明，在检测的47只绵羊中，有6只绵羊存在胰阔盘吸虫感染，感染率为12.77%。同时我们的前期研究还发现，除胰阔盘吸虫外，在被检的47只绵羊中，还存在其它5种吸虫的感染，分别是寄生于肝脏的肝片吸虫、矛形双腔吸虫、中华双腔吸虫、东方双腔吸虫以及寄生在小肠的斯氏吸虫等，总的吸虫感染率为100%[9]。究其原因，笔者认为有以下两方面因素：一是此次调查的绵羊群所处的环境能够满足吸虫整个生活史所需条件。本次调查的羊群属于天然放牧饲养模式，该牧区水草丰茂，且吸虫的中间宿主蜗牛、陆地螺、蚂蚁等随处可见，这为吸虫生长发育提供了有利环境条件；二是目前大多数地区依然以阿维菌素为主要驱虫药物进行春秋两季常规驱虫，该药物对体表寄生虫以及胃肠道线虫有较好的驱除作用，但对吸虫几乎无效。因此建议在牧区选用阿维菌素类药物常规驱虫的同时，还应考虑选用丙硫咪唑、三氯苯咪唑或吡喹酮等药物加强对吸虫病的防治。