双酚A对骨分化及骨密度的影响及相关机制

李奕丰 郭晓英

1.中国医科大学临床一系, 辽宁 沈阳 110122 2.中国医科大学公卫学院，辽宁 沈阳 110122

双酚A(bisphenol A，BPA)是一种已知的内分泌干扰物(endocrine-disrupting chemicals，EDCs)，广泛存在于环境和日常用品中，如食物、饮料的碳酸聚酯包装材料、金属罐头的树脂内膜及其他产品的添加剂等。据报道一般人群血清中BPA浓度约为0.1～10 μmol/ L[1]。BPA与雌激素结构相似，能通过竞争结合雌激素受体调节或破坏内分泌系统，影响神经、生殖、免疫系统和代谢，与前列腺癌和乳腺癌、肥胖、骨质疏松等疾病密切相关[2]。

骨是一种对激素敏感的器官，骨骼的发育和重建受激素的精细调控。BPA通过与雌激素受体(estrogen receptor，ERs)和雄激素受体(androgen receptor，AR)结合，干扰内源性激素的稳态，抑制破骨细胞和成骨细胞分化并诱导细胞凋亡，降低血浆钙水平，进而造成骨骼几何形态、强度等方面的改变，甚至因骨代谢失常造成全身疾病[3]。本文就BPA对骨分化和骨密度影响及其机制作以综述。

1 双酚A暴露对骨分化及骨密度的影响

1.1骨分化。

骨骼的形成包括膜内成骨和软骨内成骨。膜内成骨为间充质细胞经钙化后直接成骨，多见于扁平骨，如颅盖骨及面骨。躯干骨及四肢骨则是以软骨内成骨方式形成，先形成软骨雏形，随之软骨逐渐被替换，形成骨组织。BPA对膜内成骨的影响尚未见报道。目前BPA对软骨内成骨的研究多集中在对股骨、椎体等的影响。骨重建的过程由成骨细胞及破骨细胞两者的动态平衡实现，受雌激素的影响。因为不同骨龄、类型的骨骼中成骨细胞、破骨细胞和骨髓细胞的ERs各亚型的数量和比例不同，而BPA对各ERs亚型有不同的亲和力。因此，特定的细胞类型和暴露的时间可能引起BPA对骨细胞的独特反应，表现出高度的发育阶段相关性及性别相关性[4]，且不同实验条件(剂量、染毒时间、实验对象)产生的效应不同。

以往的研究认为毒性水平的BPA以剂量依赖性方式(0.5～12.5 μmol/L)在体外有效抑制成骨细胞和破骨细胞的分化和活性，刺激两种细胞的凋亡[2]。不同学者对不同发育阶段的不同性别和品系鼠、采用不同剂量进行了BPA对股骨及椎体影响的研究。

Katherine等以10 μg/(kg.d) BPA灌胃C57BL/6 J小鼠，从妊娠第11天到产后第12天，结果显示BPA增加股骨长度且在雄性中更具统计学意义，增强雄性而减弱雌性股骨抗扭承载力[4]。这种股骨长度增加和拉伸减少的综合效应导致扭转极限减小，这些结果提示了发育暴露于环境相关水平的PBA对骨分化的负面作用。由同一小组的两项不同研究，则提示了不同剂量BPA对不同性别大鼠后代的骨分化的不同影响：对Wistar大鼠孕哺期染毒[0、25、250、5 000μg和50 000μg BPA/(kg.d) ]的结果为25和5 000μg的雌性后代股骨伸长分别为1.8%和2.1%，暴露于25μg BPA的雄性后代股骨干骨皮质显著较厚(4.7%)[3]；更低剂量的研究发现，在妊娠3.5 d直到出生后第22天分别用0.5和50μg BPA/(kgBW.d)感染Fischer 344大鼠，5周龄时处死子代，结果提示雄性子代股骨分别变短2.2%和1.8%，降低了雄性子代总矿物质含量、总横截面积、小梁面积、骨膜周长以及骨内膜周长，而对雌性无明显作用[5]。此外，Auxietre等[6]在妊娠和哺乳期间口服给予雌性Wistar大鼠BPA，在出生后第30、110天(d30，d110)研究F1和F2后代的骨骼异常。对椎骨的研究数据显示F1雌性横突间宽度增加，椎骨变短，生长板厚度特别是肥大区厚度减少，而对F1雄性及所有F2个体无明显影响，这种效应在雌性F1大鼠出生30 d达到最大并于110 d消失。

间充质干细胞具有多种分化潜能，可以分化为脂肪、骨及肌肉组织，BPA促进间充质干细胞脂肪分化，抑制骨分化[1]。但近期在人间质干细胞分化研究中的结果则表明：非毒性低浓度(1和10 nmol/L)的BPA会刺激成骨，但没有明显的剂量-效应关系，且仅出现于间质干细胞分化前预处理的情况下[7]。

1.2 骨密度。

尽管在前述实验条件下观察BPA对骨密度无明显影响[3,5]，更多研究证实BPA暴露可降低骨密度。Zhang等[8]给4 周龄雌性 F344 大鼠灌胃给药50、200、400 mg /(kg.d)，13周后测定椎体及股骨骨密度，结果显示200 mg BPA/(kg BW.d)组椎体骨密度最低，50 mg BPA/(kg BW.d)组股骨骨密度最低，提示BPA降低骨密度，而苯甲酸雌二醇EB增加椎体骨密度增高，证实雌激素可减少骨流失。

如前所述BPA刺激间质干细胞脂肪分化而抑制其骨分化，而有学者在绝经前女性群体中证实BPA增加脂肪，但并未出现明显的骨密度改变，说明BPA对骨密度的影响可能与脂肪代谢无关[9]。

尽管由于暴露剂量及实验对象的种属差异等因素，研究结论不甚一致，但基本的共识是环境剂量暴露BPA 负向影响成骨分化和骨密度，引起骨质减少、微结构恶化、增加骨脆性，诱发骨质疏松症。不同时期BPA暴露会产生不同的效应，生命早期暴露于EDCs可产生不可逆的损害，并造成一些成人时期疾病。相反，成人接触EDCs的影响往往是可逆的，但鉴于BPA存在的广泛性和强脂溶性，其对于成年个体骨质的损害也不容忽视。

2 双酚A影响骨代谢的作用机制

2.1BPA的抗雌激素效应及雌激素效应

BPA与雌激素(estrogen，E2)没有结构同源性，但通常作为异雌激素并选择性调节ERs。研究表明，虽然BPA对ERs的亲和力较低，但它的影响强于E2，尤其是对非经典途径的作用，如G蛋白偶联受体(GPER)和雌激素相关受体(ERR)。BPA通常表现出雌激素拮抗效应，少数情况会显示雌激素效应，取决于ER亚型和所涉及的组织[2]。

E2有维持骨骼的功能，如抑制促破骨细胞形成配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)表达，抑制白细胞介素(IL-1、6和11)、前列腺素(PGE-2)、TNF-α、TGF-β和胰岛素样生长因子(IGF)系统，通过减弱破骨细胞活性或直接调节破骨细胞功能来减少骨吸收。E2促进成骨细胞的增殖和分化，并维持钙稳态，保证血浆钙水平。BPA通过结合雌激素相关受体-γ(ERγ)产生雌激素拮抗作用，增加RANKL的表达，提高破骨细胞的活性，抑制成骨细胞分化，降低血浆钙水平[10]。

区别于ERγ，BPA结合ERα造成雌激素效应，如BPA改变蛋白激酶C的亚型，加速哺乳动物软骨的老化和骨骺闭合。Auxietre等[6]研究BPA对椎骨横突的形态改变，发现孕哺乳期染毒使雌性个体到椎体生长板特别是肥大区的缩小，这种效应在出生后30 d达到最大，提示骨骼的早熟，该现象为雌激素效应。研究者通过加入雌激素受体的抑制剂和激动剂，证实了上述改变为BPA的雌激素效应导致。

2.2BPA对雄激素受体(AR)的作用

雄激素受体在骨发育和骨转换中发挥着重要的作用，能增加培养中骨细胞的ALP阳性细胞的数量和阳性强度，促进骨细胞分化。在对大鼠的研究中，雌激素对雌性骨骼发育的作用更加明显，使股骨更短更薄。而BPA对雄性骨骼的影响更显著，这表明BPA暴露的影响可能不仅仅是雌激素受体相关效应[5]。有基因测定报告证明，BPA是AR拮抗剂，通过多种机制作用于雄激素受体。

2.3BPA调控凋亡相关因子

在各种病理及生理状态下凋亡参与调控骨组织的发育、生长和稳态。前期研究证实BPA调控凋亡相关通路，促进凋亡。BPA调控Bcl-2家族Bad元件，从而影响凋亡效应因子Caspase8、9和3的激活。同时，BPA影响调控凋亡的NFATc1、MAPK、ERK和AKT等重要信号通路。体内体外研究均证实BPA还通过诱导氧化应激来刺激凋亡，总尿BPA水平与氧化应激水平呈高度正相关[2,10-11]。

2.4BPA参与DNA表观修饰

位于细胞核的雌、雄激素受体分别与相应激素结合后激活，配体-受体复合物进入细胞核，作为转录因子结合DNA特定基因，调节基因表达，这种效应不会遗传给子代。早期研究认为，BPA孕哺期染毒对软骨内成骨的影响不能够遗传，然而Jacques等[12]的研究中，BPA使雄性大鼠足趾比例雌性化可以遗传给子代，猜测与DNA表观修饰有关。表观遗传机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰(乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等)以及microRNAs在内的非编码RNA的表达。BPA暴露可以诱导持久的表观遗传破坏，BPA很可能通过CpG位点的甲基化作用影响表观遗传机制，并诱导了组蛋白修饰，改变了染色质结构和转录活性。双酚A促进小鼠乳腺中组蛋白甲基转移酶EZH2(Enhancer of Zeste Homolog 2)蛋白的翻译，通常会增加H3K27me3而导致基因抑制[13]。

然而表观遗传不表现在对股骨长度的影响上。近期Xin等[14]研究了BPA对骨的作用有无母系传代效应，综合Auxietre等[6]对父系传代效应的研究，BPA造成的影响在实验条件下不能证明影响F2股骨形态和强度。

2.5BPA参与Wnt /β-catenin信号对骨代谢的调控

Wnt/β-catenin信号是调节胚胎发育的经典通路，BPA通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响干细胞增殖分化的学说被广泛认同。在骨分化的调控中，BPA抑制Wnt/β-catenin信号通路从而干扰骨骼代谢。一项应用斑马鱼的研究表明BPA暴露上调凋亡是由于Wnt3a 诱导的促凋亡改变。Wnt /β-catenin信号既受到活性氧簇的调节(即受氧化应激条件的干扰)，又参与由ROS改变细胞存活程序造成的细胞死亡；Wnt/β-catenin能抑制RANKL的表达和上调成骨细胞分泌的骨保护素(osteoprotegrin，OPG)的表达，OPG能结合RANKL而抑制破骨细胞的活化[10,15]。可见BPA干扰骨骼的多种信号通路之间、成骨细胞和破骨细胞之间相互联系与制约。

3 小结

BPA复杂的分子使其影响具有双重性，例如BPA一方面提高破骨细胞的活性，另一方面通过凋亡相关蛋白和氧化应激途径引起成骨细胞和破骨细胞凋亡。因此，BPA对不同物种、相同物种不同发育阶段的影响差异很大。不同品系、剂量、染毒方式干扰对实验结果的分析，以往实验结论停留在与上述因素相关，具体影响的方式还需更加系统的实验。目前BPA对骨骼机制的研究多为推测，尚不能确定。因此，为了解BPA对人类骨骼发育的干扰和损伤效果，有必要进行关于BPA对特定组织特定发育阶段的作用机制的研究。