S/D灭活猪血浆中磷酸三丁酯含量测定

余双英 刘璐 张军东

摘 要 建立气相色谱法测定S/D灭活猪血浆中磷酸三丁酯的含量测定方法，并进行方法学验证。该方法以正己烷为萃取剂，采用了聚乙二醇毛细管柱Agilent DB-WAX（30 m×0.53 mm×1 mm）、氢火焰离子化检测器（FID）进行检测。方法学验证结果显示，该方法专属性良好，线性范围为0.034 1～0.102 4 mg/ml；中间精密度所得相对标准偏差RSD仅为1.09%（n=12）；以80%、100%、120%浓度水平测定的平均回收率分别为99.38%、95.66%、99.13%，9组准确度溶液测得回收率的总平均值为98.06%（n=9），RSD为2.72%（n=9）。该方法专属性较强，精密度、准确度、稳定性良好，可作为S/D灭活猪血浆中磷酸三丁酯的含量测定方法。

关键词 气相色谱 猪血浆 磷酸三丁酯 含量测定

中图分类号：R927.11； R982 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）13-0065-03

Determination of the tributyl phosphate in S/D inactivated pig plasma by gas chromatography

YU Shuangying*， LIU Lu， ZHANG Jundong**

（ Shanghai Haohai Biological Technology Co.， Ltd.， Shanghai 200052， China）

ABSTRACT A gas chromatography method for the determination of tributyl phosphate in S/D inactivated pig plasma was established. Gas chromatography was performed using n-hexane as an extractant by a hydrogen flame ionization detector （FID） on an Agilent DB-WAX column （30 m×0.53 mm×1 mm）. The results of methodological verification showed that the method had good specificity with a linearity over the range of 0.034 1-0.102 4 mg/ml. The relative standard deviation （RSD） obtained from the intermediate precision was only 1.09% （n=12）. The average recovery rates from three samples at different concentrations （80%， 100%， 120%） were 99.38%， 95.66%， 99.13%， respectively. The total recovery rate was 98.06% （n=9） with RSD 2.72% （n=9）. This method has good specificity， precision， accuracy and stability and can be used for the determination of tributyl phosphate in S/D inactivated pig plasma.

KEy WORDS gas chromatography； pig plasma； tributyl phosphate； content determination

豬源纤维蛋白黏合剂主要是由猪纤维蛋白原、猪凝血酶及相应的溶解液组成的一种复合制剂，临床常用于术中辅助止血[1]，生物相容性好、无毒无刺激，能有效黏附于创口起到良好的止血和促进创口愈合的作用[2-6]。为提高产品质量，降低该类产品传播动物病毒的风险，本公司参照《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》中“有机溶剂/去污剂（S/D）处理法”[1，7]对猪血浆进行病毒灭活，其中所用的有机溶剂为磷酸三丁酯。因此，在实际生产工艺中，为保证病毒灭活效果，提高终产品的临床使用安全性，磷酸三丁酯的质量控制十分重要。

本方法主要参考中国药典2015年版四部磷酸三丁酯残留量测定法[8]，并适当进行了改进。其测定原理为：利用高氯酸将血浆中的蛋白进行沉淀，用正己烷萃取溶液中的磷酸三丁酯和磷酸三丙酯，离心，取上层清液，利用配置氢火焰离子化检测器（FID）的气相色谱仪测定磷酸三丁酯含量。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

猪血浆（公司自产，批号：20170207、20170209、20170210）；磷酸三丁酯和磷酸三丙酯（对照品，美国Sigma-Aldrich公司）；高氯酸和磷酸三丁酯（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；正己烷（HPLC级，海迈瑞尔化学技术有限公司）；聚山梨酯-80（药用级，湖南华日制药有限公司）。

1.2 仪器

7890B气相色谱仪（美国Agilent公司）；ME104分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Vortex-Genie 2涡旋混合器（Scientific Industries公司）；H1650台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发公司）。

1.3 色谱条件

Agilent DB-WAX聚乙二醇毛细管柱（30 m×0.53 mm×1 mm）；进样口温度190 ℃，无分流模式；进样量1 ml；FID检测器温度210 ℃，空气400 ml/min，氢气40 ml/min，氮气25 ml/min；于160 ℃运行15 min。

1.4 溶液及样品配制

内标储备液（400 mg/ml）：精密称重磷酸三丙酯对照品40 mg，置100 ml量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀。

对照品溶液：精密称重磷酸三丁酯对照品60 mg，置100 ml量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，混匀，即为对照品储备液（600 mg/ml）。精密量取0.5 ml对照品储备液、0.5 ml内标储备液和3.5 ml正己烷，混匀，即得（STD溶液）。

样品溶液：称取一定质量的血浆于烧杯中，加入血浆质量比3%的聚山梨酯80，搅拌至完全溶解，再加入血浆质量比3%的磷酸三丁酯，混匀后，取6 ml于100 ml容量瓶中，用纯化水定容，作为样品储备液（S/D灭活血浆）。准确量取0.5 ml样品储备液和0.1 ml高氯酸溶液（1.5 mol/L）于10 ml离心管中，振荡混匀，于37℃水浴10 min，冷却至室温，再加入0.5 ml内标储备液和4 ml正己烷，混匀后，3 000 r/min离心20 min，吸取上层清液进样分析。

空白基质：同上配制不含磷酸三丁酯的空白基质溶液。

1.5 方法学验证

1.5.1 专属性

分别取按照1.4项下方法制备的对照品溶液（STD溶液）、空白基质和正己烷（空白溶液）适量于进样瓶中，按照1.3项下色谱条件进样分析。空白溶液、空白基质和对照品溶液色谱图见图1。

1.5.2 线性

精密量取对照品储备液（600 mg/ml）0.75、0.60、0.5、0.4和0.25 ml于离心管中，再分别加入内标储备液（400 mg/ml）0.5 ml和相应体积的正己烷，使得各线性溶液总体积均为4.5 ml，混匀后，按照1.3项下色谱条件各进样1次。以各磷酸三丁酯对照品峰面积与内标峰面积比，对磷酸三丁酯对照品浓度作线性回归，求得直线回归方程。

1.5.3 准确度

取9支10 ml离心管，每3支为一组，分别加入0.25 ml样品储备液，再分别加入0.20 ml、0.25 ml、0.30 ml对照品储备液，再各加入0.1 ml高氯酸溶液，振荡混匀，置于37 ℃水浴10 min，冷却至室温，加入0.5 ml内标储备液和4 ml正己烷，混匀后，3 000 r/min离心20 min，取上层清液，按照1.3项下色谱条进样分析，分别命名为R80%-1～R80%-3、R100%-1～R100%-3、R120%-1～R120%-3。

1.5.4 精密度（重复性/中间精密度）

在不同的日期，由两位研究员分别按照1.4项下的样品制备方法平行制备6份样品溶液，并按照1.3项下色谱条件进样分析，比较两位研究员测定结果，并计算12组结果的RSD。

1.5.5 溶液稳定性

取样品溶液和对照品溶液（STD溶液），放置在室温条件下，以预定的时间间隔进样分析，计算溶液在不同时间点和0时间点磷酸三丁酯含量的比值。

1.5.6 耐用性

固定其他色谱条件或样品处理方法不变，实验方法发生微小变动，如调整离心转速为（3 000±500）r/min、调整柱温为（160±2）℃、選用两种不同批次的色谱柱、调整载气流速为（8.0±0.2）ml/min，考察其耐用性。

2 结果

2.1 专属性

空白溶液和空白基质在磷酸三丁酯峰的保留时间（约11.3 min）处均没有干扰，内标物均出峰正常（约4.9 min），说明该方法专属性良好（见图1）。

2.2 线性

线性方程为y=25.829 3x-0.063 8，线性相关系数r=0.999 8，满足接受标准（r≥0.990）。

2.3 准确度

3组不同浓度样品的回收率分别为99.38%、95.66%、99.13%，9组样品的总平均回收率为98.06%（n=9），RSD为2.72%（n=9），满足接受标准（RSD≤5.0%）（表1）。

2.4 精密度（重复性/中间精密度）

两位实验员测得12份样品中磷酸三丁酯含量的平均值为10.41 mg/ml，RSD为1.09%（n=12），结果满足接受标准（RSD≤5.0%）（表2）。

2.5 溶液稳定性

对照品和样品溶液于室温放置48 h后，在各相应稳定性时间点磷酸三丁酯含量与0时间点测得含量的比值均在95.0%～105.0%之间，说明样品和对照品稳定性良好（表3）。

2.6 耐用性

各参数微调后测得结果与正常条件下测得磷酸三丁酯含量的比值均在95.0%～105.0%，满足接受标准（95.0%～105.0%），说明该方法耐用性良好（表4）。

2.7 样品检测

取3批猪血浆（批号：20170207、20170209、20170210），按照1.4项下样品制备方法进行处理，并按照1.3项下色谱条件进样分析，测定磷酸三丁酯含量分别为10.41、10.38和10.45 mg/ml。

3 讨论

与药典[8]和文献方法[9-10]相比，本方法在样品处理时增加了正己烷与供试品的体积比，可以提高磷酸三丁酯和磷酸三丙酯的萃取效率，并增大了离心转速，可以使蛋白快速沉淀；数据处理方式上，药典方法采用线性方程计算，本方法采用单点法计算，缩短了分析测定时间，从而可以提高工作效率。该方法专属性强，准确度、精密度较好，可以用于测定S/D灭活猪血浆中磷酸三丁酯含量。

参考文献

[1] 刘璐， 赵莹莹， 张军东. 气相色谱法测定猪凝血酶冻干粉中磷酸三丁酯残留量[J]. 上海医药， 2017， 38（21）： 76-80.

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[3] 张丽铃， 何淑琴， 邓志华. 纤维蛋白胶的临床应用进展[J].实用医药杂志， 2014， 31（5）： 451-452.

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