基于双重猝灭分子信标及核酸染料Hoechst 33258对单链核酸的双色定量检测

鲁子敬 熊威威 翟琨 向东山 谭志斗

摘 要 利用鸟嘌呤（G）碱基和有机猝灭基团Black Hole Quencher 1 （BHQ-1）对荧光基团6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein group，FAM）的双重猝灭作用构建了一种结构简单的双重猝灭分子信标，结合核酸染料Hoechst 33258，以艾滋病毒RNA片段的反转录序列（33个碱基）为目标DNA，建立了一种高灵敏单链核酸（ssDNA）的双色荧光定量检测方法。此分子信标中，荧光基团及有机猝灭基团分别设计为FAM和BHQ-1，分子信标的茎的碱基全部设计为C-G碱基对，环的碱基序列设计为目标DNA的互补序列，与BHQ-1相连接的为3个带有G碱基的核苷酸。没有目标DNA时，分子信标呈茎-环结构，荧光基团FAM与有机猝灭基团BHQ-1及G碱基距离很近，在BHQ-1及G碱基的双重猝灭下，FAM的荧光很弱;另外，分子信标的茎的碱基全部是C-G碱基对，不能与核酸染料Hoechst 33258相结合，因此Hoechst 33258的荧光也很弱。当有目标DNA存在时，分子信标的环与目标DNA杂交形成双链，茎-环结构被破坏，FAM远离猝灭基团BHQ-1及G碱基，其荧光得到恢复; 同时，核酸染料Hoechst 33258與双链DNA中的A-T碱基对相结合，其荧光显著增强。根据荧光基团FAM及核酸染料Hoechst 33258荧光增强的程度可实现对ssDNA的定量检测。在优化的条件下，目标DNA的浓度在0.05～8.0 nmol/L范围内时，FAM和Hoechst 33258的总荧光强度（ΔIT）与目标DNA的浓度（C）具有良好的线性关系，回归方程为ΔIT=192.2C + 115.08 （R2=0.9938），检出限为20 pmol/L （3σ， n=9）。此方法操作简单、灵敏度高、选择性好、检出限低。

关键词 双重猝灭分子信标; 单链核酸; Hoechst 33258; 双色荧光; 定量检测

1 引 言

单链核酸的检测在分子生物学、遗传学、分子医学及食品科学等领域都具有十分重要的意义[1～5]。分子信标（Molecular beacons）是一种具有高选择性的茎-环结构的寡核苷酸探针，广泛用于核酸、蛋白质、药物分子及金属离子的分析与检测，尤其是单链核酸的检测中[6，7]。Hoechst 33258是一种高灵敏的染料，在水溶液或单链DNA溶液中荧光很弱，但与含A-T碱基对的双链DNA具有很强的亲和作用，且与双链DNA结合后，荧光强度会显著增加[8～11]。

传统的分子信标在检测DNA时，与某些荧光染料相比，其灵敏度相对较差[12，13];此外，传统的分子信标中有机猝灭基团对荧光基团的猝灭效果不是很好，背景信号偏高，影响方法灵敏度[14，15]。

为降低传统分子信标的背景荧光，许多研究者对分子信标的有机猝灭基团进行了改进，如Adegoke等[14]用纳米金替代分子信标的有机猝灭基团，Oh等[15]利用氧化石墨烯替代分子信标中的猝灭基团。这些改进都极大地降低了分子信标的背景，但这类分子信标制备过程复杂，成本高。为提高分子信标检测的灵敏度，本研究组在利用分子信标进行检测时引入了荧光染料 [12，13，16]，显著提高了检测的灵敏度，但也导致了荧光背景增加， 如利用分子信标及荧光染料SYBR GreenⅠ建立了一种双色荧光定量检测DNA的方法[13]，引入荧光染料SYBR GreenⅠ，显著提高了检测的灵敏度，但荧光染料SYBR GreenⅠ能与分子信标茎的碱基发生作用，与双链作用无选择性，导致荧光背景信号增加[17]。

本研究利用鸟嘌呤（G）碱基和有机猝灭基团BHQ-1对荧光基团FAM的双重猝灭作用，设计了一种分子信标，并结合核酸染料Hoechst 33258，建立了一种单链核酸的高灵敏双色荧光定量检测方法。在此方法中，引入的核酸染料Hoechst 33258可以和分子信标与目标DNA杂交后形成的双链DNA作用，使荧光信号显著增强，因此可显著提高检测的灵敏度。另外，本研究对分子信标进行了两方面改进，一是利用G碱基和有机猝灭基团对荧光基团进行双重猝灭，使分子信标本身的荧光背景信号显著下降[18];二是分子信标的茎的碱基全部设计为C-G碱基对，核酸染料Hoechst 33258不能与之结合，因此引入的荧光染料几乎没有荧光背景信号，从而降低检出限，显著提高了检测灵敏度。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

RF-5301PC型荧光光谱仪（日本Shimadzu公司）。

Hoechst 33258购于北京泛博生物化学有限公司;其它试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。所用缓冲溶液为0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲溶液;分子信标和所有的寡核苷酸序列均由上海生工生物技术有限公司合成，序列见表1。

2.2 样品的制备

首先，将分子信标用 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲溶液（pH 8.0）配制成80 nmol/L储备液，再将目标DNA配制成不同浓度的溶液。将50 μL不同浓度的目标DNA加入到50 μL 80 nmol/L分子信标溶液中，混合均匀，在50℃水浴中加热5 min，冷却至室温后，加入Tris-HCl缓冲溶液至终体积为 450 μL，加入50 μL 2 μmol/L Hoechst 33258，在室温下反应8 min，检测体系的FAM及Hoechst 33258的荧光信号。在方法灵敏度的考察实验中，首先将不同的目标DNA用0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲溶液（pH 8.0）配制成60 nmol/L的储备液，再分别取50 μL目标DNA及互补DNA混合均匀，室温下反应5 min，加入50 μL 2 μmol/L Hoechst 33258，在室温下反应8 min，检测Hoechst 33258的荧光信号。

2.3 目标DNA的检测

通过检测反应后体系中FAM及Hoechst 33258的荧光信号实现目标DNA的检测。对FAM荧光的检测采用同步荧光分析法，同步扫描的波长间隔（Δλ）为26 nm，最大发射波长为526 nm。检测Hoechst 33258的荧光信号时，最大激发波长为346 nm，最大发射波长为463 nm，激发及发射狭缝宽度均为10 nm。 检测波长均为FAM及Hoechst 33258的最大发射波长。

2.4 方法选择性考察

50 μL 80 nmol/L目标DNA序列和相同浓度的碱基错配序列均按2.2节的方法进行配制，分别检测体系中FAM及Hoechst 33258的荧光信号，最后对总的荧光强度进行比较和分析。

3 结果与讨论

3.1 检测原理

利用双重猝灭分子信标及Hoechst 33258检测DNA的原理如图1所示。双重猝灭分子信标的荧光基团设计为FAM，猝灭基团为BHQ-1，分子信标的茎由8对核苷酸组成，碱基组成全部为C-G碱基对，与BHQ-1相连接的为3个带有G碱基的核苷酸，分子信标的环由33个核苷酸組成，其碱基序列为目标DNA的互补序列。没有目标DNA时，分子信标呈茎-环结构，荧光基团FAM与有机猝灭基团BHQ-1及G碱基相互靠近，在BHQ-1及G碱基的双重猝灭下，FAM的荧光信号很弱;此外，分子信标的茎的碱基全部设计为C-G碱基对，不能与核酸染料Hoechst 33258相结合，因此Hoechst 33258的荧光也很弱。当目标DNA存在时，分子信标与目标DNA杂交形成双链DNA，茎-环结构被破坏，FAM远离猝灭基团BHQ-1及G碱基，其荧光得到恢复;同时，核酸染料Hoechst 33258与双链DNA中的A-T碱基对相结合，其荧光信号也显著增强。根据荧光基团FAM及核酸染料Hoechst 33258荧光增强的程度即可实现对单链核酸的双色定量检测。

3.2 可行性分析

图2为不同浓度的目标DNA与相同浓度的分子信标和Hoechst 33258作用后，FAM和Hoechst 33258所对应的荧光光谱图。在没有目标DNA存在时，FAM和Hoechst 33258的荧光信号都很弱（图2A-a，图2B-a）;目标DNA存在时，FAM和Hoechst 33258的荧光强度都显著增加，且DNA浓度越高时，FAM和Hoechst 33258荧光增强程度越大（图2A-b，c，图2B-b，c）。另外，当目标DNA存在时，分子信标打开，此时其两端的荧光基团FAM和猝灭基团BHQ-1距离嵌入双链DNA的Hoechst 33258分子都很近。Hoechst 33258与FAM之间可能存在荧光共能量转移，猝灭基团BHQ-1也可能对Hoechst 33258的荧光有一定的猝灭作用。从图2B可见，采用346 nm激发光时，未观察到FAM的荧光峰，说明在Hoechst 33258与FAM之间不存在荧光共振能量转移;Hoechst 33258的最大发射波长（本实验的检测波长）为463 nm，而猝灭基团BHQ-1的猝灭范围在480～580 nm之间，BHQ-1不会对Hoechst 33258检测波长处的荧光有猝灭作用。因此，利用本方法对目标DNA的双色定量检测是可行的。

3.3 实验条件的优化

3.3.1 Hoechst 33258浓度的选择 核酸染料Hoechst 33258和与含A-T碱基对的双链DNA结合后才会产生荧光，在分析体系中通常采用相对过量的Hoechst 33258，以保证可与所有杂交形成的双链DNA结合，但浓度过大又会产生背景信号。实验表明，在分子信标及目标DNA浓度均为8 nmol/L时，Hoechst 33258的浓度在0～100 nmol/L范围内，其荧光强度随浓度的增加而增大;当Hoechst 33258浓度超过100 nmol/L后，其荧光强度不再发生变化。为了保证分析体系中Hoechst 33258相对过量，本实验选择其浓度为200 nmol/L。

3.3.2 pH值对检测的影响 缓冲体系的pH值不仅可以影响分子信标与目标DNA的杂交效果，还可能直接影响荧光染料的发光强度。在pH<8.0时，FAM与Hoechst 33258的总荧光强度随着pH值的增大而增大，在pH=8.0时达到最大，说明目标DNA的检测在略偏碱性的缓冲溶液中效果较好。因此选择pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液。

3.3.3 Hoechst 33258与双链DNA作用时间的影响 Hoechst 33258只有与双链DNA中的A-T碱基对结合后才会发出较强的荧光。对Hoechst 33258与双链DNA的结合时间进行了考察。结果表明，结合时间小于8 min时，Hoechst 33258的荧光强度随着时间的延长而增加;当结合时间超过8 min后，Hoechst 33258的荧光强度几乎不再发生变化，说明Hoechst 33258与双链DNA的结合在8 min内已完成。因此， Hoechst 33258与双链DNA的结合时间选择为8 min。

3.3.4 目标DNA中A-T碱基的数量对方法灵敏度的影响 Hoechst 33258只与双链DNA中的A-T碱基对作用，因此目标DNA中A-T碱基的数量直接影响染料Hoechst 33258的荧光强度，从而影响方法的灵敏度。本实验所使用的分子信标环的碱基总数为33个，与目标DNA反应后形成的双链DNA中共有33对碱基。因此设计了5种总碱基数均为33个，含A-T碱基的数量分别为0、7、14、21和28个的DNA（表1），对单链DNA中A-T碱基的数量与Hoechst 33258荧光强度的关系进行了考察。结果表明，单链DNA中A-T碱基的数量越多，Hoechst 33258的荧光强度越大，即目标DNA中A-T碱基的数量越多，方法的灵敏度也越高。

3.4 方法的分析性能

在优化的条件下，检测不同浓度目标DNA存在下的FAM和 Hoechst 33258荧光强度（图3及图4）。结果表明，目标DNA的浓度在0.05～8.0 nmol/L范圍内，FAM和 Hoechst 33258的荧光强度（ΔI，ΔI=I-I0， I0表示没有目标DNA的荧光强度，I表示有目标DNA的荧光强度）与目标DNA的浓度（C）均呈良好的线性关系（图4A和4B），回归方程分别为ΔI1=84.9+C + 6.83 （R2=0.9928）， ΔI2=109.9C + 69.11（R2=0.9981）。另外，FAM和 Hoechst 33258总的荧光强度（ΔIT， FAM在525 nm处的荧光强度与Hoechst 33258在463 nm处的荧光强度之和）与目标DNA的浓度（C）也具有良好的线性关系（图4C），线性方程为ΔIT=192.2C + 115.08 （R2=0.9938），检出限为20 pmol/L （3σ， n=9）。上述结果表明，利用FAM和 Hoechst 33258总的荧光强度对目标DNA进行检测时，工作曲线的斜率均大于利用FAM或 Hoechst 33258单独的荧光强度对目标DNA进行检测时的斜率，灵敏度更高。对9个相同浓度的目标DNA（500 pmol/L）进行测定，其相对标准偏差（RSD）为 2.3%，精密度良好。与其它已报道的利用分子信标对单链DNA的检测方法相比（表2），本方法的灵敏度更高，检出限更低。

3.5 方法的选择性

采用本方法检测了浓度均为8 nmol/L的目标DNA、单碱基错配的DNA、双碱基错配的DNA及三碱基错配的DNA（图5）。结果表明，单碱基错配的DNA、双碱基错配的DNA及三碱基错配的DNA所对应的荧光强度（ΔIT）都远低于目标DNA所对应的荧光强度，表明本方法具有良好的选择性。

3.6 实际样品中目标DNA的检测

将两个相同浓度的目标 DNA分别用缓冲溶液和人血清稀释至800 pmol/L，并分别用缓冲溶液和人血清做空白实验，扣除空白值（背景荧光）后，两者总的荧光强度（ΔIT，FAM与Hoechst 33258的荧光强度之和）基本一致，表明本方法具有良好的实用性，可用于复杂样品的分析。

4 结 论

利用G碱基和有机猝灭基团BHQ-1对荧光基团FAM的双重猝灭作用构建了一种结构简单的双重猝灭分子信标，结合核酸染料Hoechst 33258，建立了高灵敏的双色荧光定量检测单链核酸的方法。本方法降低了荧光背景信号，从而降低了方法的检出限，显著提高了检测灵敏度。

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