2种外源钙对镉胁迫三七生理生化特性及其镉积累的影响

李 娜， 李 涛， 梅馨月， 阮明菊， 吴艳琼， 祖艳群

(云南农业大学 资源与环境学院， 云南 昆明 650201)

随着矿产资源大量开发利用，各种化学产品、农药、地膜、化肥的广泛使用以及城市污泥、污水在农业上的利用，重金属对土壤水体的污染也越来越严重[1]。镉是常见的重金属污染物，不能被微生物降解，并且在土壤中滞留时间长；镉的生物迁移性很强，可在植物根、茎、叶及籽粒中大量积累[2-7]。钙不仅是三七生长发育必需的一种营养元素，也是三七体内重要的调节因子，其不仅能够维持细胞壁、细胞膜及膜结合蛋白的稳定性，还可作为第二信使参与植物体内多种代谢活动，在反应中也会作为关键离子起到酶促作用[8-10]。施用外源钙可有效减少植物体内镉的含量。有研究表明，施用外源钙能够缓解镉对水稻籽粒造成的伤害[11]。目前有关外源钙处理与镉胁迫相互作用的报道多集中在农作物和重金属修复植物上，主要涉及外源钙处理对植物镉吸收的影响及对镉胁迫下植物叶绿素含量的影响等方面，而外源钙处理对镉胁迫下植物其他生理代谢的影响报道较少[12-13]。

三七(Panaxnotoginseng) 又名血参、田七等，为五加科人参属多年生草本植物。干燥块根入药，具有止血、活血、散瘀、定痛、滋补、降压、降脂、降血糖、免疫调节等功效[14]。据报道，云南省文山州富含锌、铜、铅等(非)金属矿，土壤重金属背景值相对较高[15-18]。近年来，随着采矿区域的无序扩张以及含金属农药的大量使用，三七种植区土壤重金属污染问题日益严重，对三七药品安全产生严重威胁，三七重金属含量超标已有许多报道[19]。由于三七为喜阴性宿根性植物，种植 3年后具有较好的药用价值。 在种植期间，极易遭受各种病虫的危害，严重影响三七的品质和产量。为保证三七的产量，在种植过程中不得不使用化学农药，造成三七产品中偶有农药和三七重金属含量超标的现象[20]。为保证三七用药安全，笔者等通过盆栽方法，探讨施用氯化钙和石灰对镉胁迫2年生三七生物量、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性、丙二醛(MDA)含量及三七不同部位对镉累积的影响，以期为三七种植业的健康持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

三七，1年生籽苗(文山丘北道地材料)，CdCl2·2.5H2O(上海金山亭新化工试剂厂)，石灰(丘北石灰厂)，氯化钙(原天津市化学试剂三厂)。

土壤背景值为pH 6.18，有机质含量30.46 g/kg，全氮0.36 g/kg，全磷13.69 g/kg，全钾10.48 g/kg，碱解氮19.25 mg/kg，速效磷181.83 mg/kg，速效钾188.19 mg/kg，镉含量0.30 mg/kg，钙含量40.85 g/kg。

1.2 试验设计

试验在云南农业大学大河桥现代农业教育科研基地(海拔1 870 m，N25°31′1″，E103°16′48″)进行。采取盆栽试验方法，每盆装土17 kg。试验共设置4个Cd2+浓度梯度，分别为0 mg/kg、0.6 mg/kg、6.0 mg/kg和12 mg/kg ，采用CdCl2·2.5H2O配制。氯化钙和石灰设置3个Ca2+浓度梯度，分别为0 mg/kg、180.2 mg/kg和360.4 mg/kg。各个浓度梯度的Cd2+与氯化钙和石灰交互处理，共24个处理。其中，镉、氯化钙和石灰浓度均为0 mg/kg的处理为对照，各处理与盆栽土壤混合均匀，每个处理5次重复。土壤平衡2 周后，每盆土中移栽1年生三七籽苗6株。移栽后，盆口覆盖3 cm云南松松针，以保持盆内水分，按常规栽培管理进行。

1.3 考察指标的测定

1.3.1 株高 在三七成熟期，采用量尺对三七地上茎基部分至复叶柄基部的长度(不含花轴)进行测定。

1.3.2 生物量的测定 于三七成熟期，将采集到的七植株主根、剪口、须根及茎叶在105℃下杀青0.5 h，随即在80℃下烘干至恒重，用分析天平称重。

1.3.3 植物镉含量的测定 在成熟期收获全株植物，分为不同部位后，准确称取0.2 g植物样品于三角瓶中，放入数粒玻璃珠，加入10 mL混合酸，(HNO3∶HClO4为4∶1)，加盖浸泡过夜，在三角瓶口加一小漏斗后于电炉上进行消解，若变为棕黑色再加混合酸，直至冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色，放冷用滴管将试样消化液滤入10 mL容量瓶中并定容至刻度,混匀备用，同时做试剂空白。用火焰原子吸收分光光度计测定镉含量[21]。

1.3.4 SOD、POD、CAT活性和MDA含量测定 在三七旺盛生长期采集主根样品，放入冻存管，液氮速冻，速冻后移入-80℃冰箱保存，待测。准确称取植物样品0.5 g于研钵中，加入pH 7.8的磷酸缓冲溶液5 mL，冰浴条件下尽快研磨至匀浆，然后以4 000 r/min于4℃离心10 min，取上清液用于试剂盒测定，采用酶标仪〔北京普朗新技术有限公司，DNM-9602，产品注册号:京药监械(准)字2013 第2400147 号〕测定OD值，计算CAT、POD、SOD活性和MDA含量[22]。

1.4 数据分析

使用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 2种外源钙对镉胁迫三七株高的影响

从图1可知，未施用钙时，不同浓度镉胁迫下，三七株高呈先增后降趋势，各处理间差异不显著。在不同浓度镉胁迫下，施用氯化钙处理均可促进三七株高的生长，且不同浓度氯化钙处理的三七株高均显著高于未施用氯化钙处理。其中，在不同浓度镉胁迫下，施用氯化钙180.2 mg/g处理的株高较未施用氯化钙的处理增加0.25%～0.5%，360.4 mg/kg氯化钙处理的株高较未施用氯化钙的处理增加3%～45.6%。不同浓度镉胁迫下，施用石灰能够增加三七的株高，在0.6 mg/kg镉胁迫下，施用180.2 mg/kg石灰处理与360.4 mg/kg和未施用石灰处理差异显著，180.2 mg/kg石灰处理的三七株高较未施用石灰的株高增加32.7%。在6.0 mg/kg和12.0 mg/kg镉胁迫下，施用360.4 mg/kg石灰处理与180.2 mg/kg石灰处理和未施用石灰处理差异显著。在6.0 mg/kg和12.0 mg/kg镉胁迫下，施用360.4 mg/kg石灰处理的株高分别较未施用石灰处理增加25.0%和37.6%。

注：图中不同小写字母表示相同浓度镉胁迫下不同浓度钙处理间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示相同浓度钙处理下不同浓度镉胁迫间差异显著(P<0.05)。下同。

Note:Different lowercase letters in the figure indicate significant difference among different calcium treatments under cadmium stress of the same concentrations (P<0.05); Different capital letters indicate significant differences among cadmium stress at different concentrations with the same treatment of calcium(P<0.05). The same below.

图1施用氯化钙和石灰镉胁迫三七的株高

Fig.1 HeightP.notoginsengby Cd stress plus calcium chloride and lime application

2.2 2种外源钙对镉胁迫 2年生三七成熟期生物量的影响

从图2可知，不同浓度镉胁迫下，施用不同浓度氯化钙和石灰处理三七主根生物量、剪口生物量、须根生物量及茎叶生物量的变化。

2.2.1 主根生物量 未施用外源钙，不同浓度镉胁迫下，三七主根生物量呈先增后降趋势，各处理间差异不显著。在不同浓度镉胁迫下，施用氯化钙可促进三七主根生物量的积累。在0.6 mg/kg 镉胁迫下，施用180.2 mg/g氯化钙处理和360.4 mg/g氯化钙处理显著高于未施用氯化钙处理，分别较未施用氯化钙处理增加16%和33%。在其余浓度镉胁迫下，氯化钙不同浓度处理的主根生物量均与未施用氯化钙处理间差异不显著。在不同浓度镉胁迫下，施用不同浓度石灰处理的三七主根生物量均与未施用石灰处理的三七主根生物量无显著差异。

2.2.2 剪口生物量 未施用外源钙，不同浓度镉胁迫下，三七剪口生物量均显著高于无镉胁迫处理。在0.6 mg/kg和6.0 mg/kg镉胁迫下，不同浓度氯化钙处理的三七剪口生物量均与未施用氯化钙处理无显著差异。在12.0 mg/kg镉胁迫下，施用180.2 mg/kg氯化钙处理的三七剪口生物量显著高于未施用氯化钙处理。在不同浓度镉胁迫下，施用石灰处理大多数可促进三七剪口生物量的积累，但均与未施用石灰处理无显著差异。

2.2.3 须根生物量 未施用外源钙，不同浓度镉胁迫下，三七须根生物量呈先降后升趋势，各处理间差异不显著。在0.6 mg/kg和12 mg/kg镉胁迫下，不同浓度氯化钙处理三七须根生物量均较未施用氯化钙处理高，各处理间差异不显著。在6.0 mg/kg镉胁迫下，360.4 mg/kg氯化钙处理显著高于180.2 mg/kg氯化钙处理和未施用氯化钙处理，较未施用氯化钙处理高66%。不同浓度镉胁迫下，施用石灰处理均可促进三七须根生物量的积累，各处理间差异不显著。

图2 施用氯化钙和石灰镉胁迫三七各部位的生物量

2.2.4 茎叶生物量 未施用外源钙，不同浓度镉胁迫下，三七茎叶生物量呈先升后降趋势，各处理间差异不显著。在0.6 mg/kg和12 mg/kg镉胁迫下，施用氯化钙处理多数可促进三七茎叶生物量的积累。在6 mg/kg镉胁迫下，360.4 mg/kg氯化钙处理的茎叶生物量显著高于未施用氯化钙处理和180.2 mg/kg氯化钙处理，较未施用氯化钙处理高38%。不同浓度镉胁迫下，施用石灰多数可促进三七茎叶生物量的积累，各处理间差异均不显著。

2.3 2种外源钙对镉胁迫三七 MAD含量及 SOD、POD和CAT活性的影响

从表1可知，不同浓度镉胁迫下，施用不同浓度氯化钙和石灰对三七植株MAD含量、SOD、POD和CAT活性的影响。

2.3.1 MDA含量 未施用外源钙不同浓度镉胁迫下，三七植株MDA含量呈先降后升趋势。在镉浓度为12 mg/kg时，MDA含量最高，为1 738.56 pmol/g。施用外源钙后，三七植株MDA含量均较未施用外源钙的高(无镉胁迫，添加氯化钙处理6 mg/kg镉胁迫180.0 mg/kg石灰处理及12 mg/kg镉胁迫，添加石灰处理的除外) 。其中，在6 mg/kg镉胁迫处理下，施用360.4 mg/kg氯化钙的三七植株MDA含量最高，为1 926.67 pmol/g，较未施用氯化钙的高16%。在12 mg/kg镉胁迫处理下，施用180.2 mg/kg石灰处理的三七植株MDA含量最低，为1 332.71 pmol/g，较未施用石灰处理降低23%。

2.3.2 SOD活性 未施用外源钙不同浓度镉胁迫下，三七植株的SOD活性呈先升后降趋势。其中0.6 mg/kg镉胁迫处理显著高于无镉胁迫处理。0.6 mg/kg镉胁迫下三七的SOD活性较无镉胁迫处理显著增加12.4%。无镉胁迫处理与其余镉胁迫处理间无显著差异。不同浓度镉胁迫下，施用不同浓度氯化钙和石灰均使三七植株中的SOD活性下降，其中，在0.6 mg/kg镉胁迫下施用360.4 mg/kg氯化钙时，三七植株SOD活性最低，较未施用氯化钙处理的降低16.7%，在0.6 mg/kg镉胁迫下施加360.4 mg/kg石灰时，三七植株SOD活性最低，较未施用石灰处理的降低18.2%。

表1施用氯化钙和石灰镉胁迫三七茎叶 MDA含量及抗氧化酶活性

Table 1 MDA content and antioxidant enzyme activities ofP.notoginsengleaves treated with calcium chloride and lime by cadmium stress

处理 Treatment钙制剂Cd浓度/(mg/kg)Ca浓度/(mg/kg)MDA/(pmol/g)SOD/(U/g)POD/(U/g)CAT/(ng/g)氯化钙 001 597.56±45.24 aAB260.16±17.40 aB0.99±0.07 aA139.89±0.97 aBC Calcium 180.21 558.79±278.16 aA237.20±7.72 abA0.92±0.08 aA146.71±26.89 aA chloride360.41 457.17±149.86 aB233.73±8.54 bA0.94±0.04 aA119.94±20.12 aB 0.601 494.69±133.76 bB292.45±8.63 aA0.97±0.06 aA145.01±1.06 aB 180.21 814.08±10.01 aA259.03±1.4 bA0.95±0.08 aA129.88±18.53 aA360.41 512.83±122.26 bAB243.50±17.48 bA0.92±0.04 aA146.00±16.91 aAB 601 667.24±104.57 aAB288.47±13.32 aAB0.97±0.07 aA161.88±10.19 aA180.21 829.07±339.51 aA255.26±7.95 aA0.93±0.02 aA131.49±13.30 bA 360.41 926.67±380.33 aA252.70±28.66 aA0.89±0.09 aA131.21±18.73 bB 1201 738.56±149.43 aA266.45±17.21 aAB0.81±0.05 bB131.97±5.16 bC 180.21 854.15±255.02 aA261.59±22.36 aA0.88±0.09 abA135.74±2.18 bA 360.41 789.54±69.02 aAB249.46±10.37 aA0.98±0.07 aA174.58±3.97 aA石灰 Lime 001 597.56±45.24 bAB260.16±17.40 bB0.99±0.07 aA139.89±0.97 bBC 180.21 754.20±66.25 abB267.69±12.67 bA0.94±0.04 aA127.82±4.73 cBC 360.41 849.54±130.41 aA300.94±6.88 aA0.96±0.05 aAB167.53±8.20 aA 0.601 494.69±133.76 bB292.45±8.63 aA0.97±0.07 aA145.01±1.06 abB180.22 030.12±121.08 aA274.61±14.6 aA0.82±0.11 aAB153.18±3.12 aA 360.41 810.96±134.73 aA239.19±13.28 bC0.82±0.07 aB137.76±8.03 bB 601 667.24±104.57 aAB288.47±13.32 aAB0.97±0.07 aA161.88±10.19 aA 180.21 566.43±57.38 aC259.54±6.41 bA0.65±0.05 bC116.96±6.38 cC 360.41 687.16±46.28 aAB251.08±9.82 bC1.05±0.05 aA139.93±6.42 bB 1201 738.56±149.43 aA266.45±17.21 aAB0.81±0.05 aB131.97±5.16 aC 180.21 332.71±63.85 bD260.44±7.69 aA0.75±0.04 aBC137.51±8.36 aB 360.41 589.74±56.71 aB272.69±11.57 aB0.59±0.10 bC109.14±8.00 bC

注：同列不同小写字母表示相同浓度镉胁迫下不同浓度钙处理间差异显著(P<0.05，n=5)，不同大写字母表示相同浓度钙处理下不同浓度镉胁迫间差异显著(P<0.05，n=5)。下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate that there is significant difference between different concentrations of calcium treatment under the same concentration of cadmium stress (P<0.05, n=5). Different capital letters indicate significant differences between different concentrations of cadmium stress under the same concentration of calcium (P<0.05, n=5). The same below.

2.3.3 POD活性 未施用外源钙不同浓度镉胁迫下，三七植株的POD活性呈下降趋势，无镉胁迫处理0.6 mg/kg、6 mg/kg镉胁迫处理与12 mg/kg镉胁迫处理差异显著，无镉胁迫处理0.6 mg/kg和6 mg/kg镉胁迫处理间差异不显著。与无镉胁迫处理镉胁迫处理相比，12.0 mg/kg镉胁迫下三七植株的POD活性著降低18.2%。在不同浓度镉胁迫下，施用氯化钙和石灰处理多数使三七植株的POD活性下降。

2.3.4 CAT活性 未施用外源钙不同浓度镉胁迫下，三七植株的CAT活性呈先升后降趋势，其中无镉胁迫处理和0.60 mg/kg镉胁迫处理与6.0 mg/kg和12 mg/kg镉胁迫处理差异显著，无镉胁迫处理与0.60 mg/kg和12 mg/kg镉胁迫处理差异不显著。与无镉胁迫处理相比，6.0 mg/kg镉胁迫下三七的CAT活性显著增加15.7%。6.0 mg/kg镉胁迫下，与未施用氯化钙相比，施用180.2 mg/kg、360.4 mg/kg氯化钙的三七CAT活性分别显著降低18.8%和18.9%。6.0 mg/kg镉胁迫下，与未施用石灰相比，施用180.2 mg/kg石灰的三七CAT活性显著降低28%。12.0 mg/kg镉胁迫下，施用360.4 mg/kg石灰的三七CAT活性较未施用石灰显著降低17.3%。

2.4 2种外源钙对镉胁迫三七镉含量的影响

由表2可知，三七不同部位镉含量依次是须根>茎叶>剪口>主根。未施用外源钙不同浓度镉胁迫下，三七主根、剪口、茎叶及须根中的镉含量均呈上升趋势，与无镉胁迫处理相比，6 mg/kg镉胁迫下三七的主根和须根的镉含量分别显著增加255%和96.7%，12 mg/kg镉胁迫下，三七的主根和须根的镉含量分别显著增加400%和161%。0.6 mg/kg、6 mg/kg和12 mg/kg镉胁迫下三七剪口和茎叶的镉含量显著上升。未施用氯化钙处理条件下，与无镉胁迫处理相比，6 mg/kg和12 mg/kg镉胁迫下三七主根、须根、剪口和茎叶的镉含量显著上升。无镉胁迫处理下，与未施用氯化钙相比，施用180.2 mg/kg氯化钙三七剪口和须根中镉含量分别降低15.8%和7.9%，施用360.4 mg/kg氯化钙三七剪口和须根中镉含量分别降低18.0%和16.4%。无镉胁迫下，与未施用石灰相比，施用360.4 mg/kg石灰三七剪口、茎叶中镉含量分别降低21.1%和16.0%。在6.0 mg/kg镉胁迫下，施用180.2 mg/kg和360.4 mg/kg氯化钙三七不同部位中镉含量较未施用氯化钙分别降低13.3%～20.7%和17.5%～22.8%；施用180.2 mg/kg和360.4 mg/kg石灰三七不同部位中镉含量与未施用石灰相比分别降低16.7%～21.1%和25.8%～33.3%。12.0 mg/kg镉胁迫下，施用360.4 mg/kg氯化钙与不加氯化钙相比，三七各部位中镉含量分别显著降低16.5%～27.5%。参照《地理标志产品文山三七》GB/T 19086-2008，镉的限量标准为0.5 mg/kg，分析比较三七各部位中的镉含量发现，在6.0 mg/kg和12.0 mg/kg镉胁迫下，三七主根和剪口中镉均严重超标；在0.6 mg/kg、6.0 mg/kg和12.0 mg/kg镉胁迫下，三七茎叶和须根中的镉含量大部分严重超标。

表2施用氯化钙和石灰镉胁迫三七不同部位镉的含量

Table 2 Contents of cadmium in different parts of P. notoginseng treated with calcium chloride and lime by cadmium stress

3 结论与讨论

研究结果表明，低浓度镉胁迫可促进三七植株株高的生长及生物量的积累，但高浓度镉胁迫，三七植株株高的生长及生物量的积累受到抑制。在不同浓度镉胁迫下，三七植株的MDA含量和抗氧化酶活性呈不同变化。随着镉胁迫浓度的升高，三七植株各部位的镉含量升高。在不同浓度镉胁迫下，施用氯化钙和石灰处理可促进三七植株株高的生长及生物量的积累，提高三七植株的MDA含量，降低三七植株的抗氧化酶活性和三七植株各部位的镉含量。其中，在6.0 mg/kg镉胁迫下，施用360.4 mg/kg氯化钙三七不同部位中镉含量较未施用氯化钙降低17.5%～22.8%，施用360.4 mg/kg石灰三七不同部位中镉含量较未施用石灰相比降低25.8%～33.3%，从对三七的降镉效应看，石灰处理优于氯化钙处理。

钙作为植物必需的营养元素之一，参与植物的多种生命活动与酶的代谢过程，生理学研究发现，外施钙可以增强植物对许多非生物逆境的适应性，减轻逆境对植物所造成的伤害[23-24]。研究表明，在镉胁迫处理浓度相同时，施用氯化钙和石灰能提高三七的株高和生物量，与李贺等[25]在大蒜的研究结果类似。6.0 mg/kg镉胁迫下，施用氯化钙180.2 mg/kg和360.4 mg/kg与不加氯化钙相比三七不同部位中镉含量分别降低13.3%～20.7%和17.5%～22.8%。因此，施用适当的外源钙能够有效降低植株各部位镉含量，与肖厚军等[26]在白菜的研究结果类似。缓解毒害作用的原因可能是Ca与膜磷脂的极性头部结合，通过交联作用，使膜脂分子和蛋白质分子结合紧密，从而降低了膜的透性减轻了镉的生理毒害。施用石灰后能降低三七对镉的吸收，石灰施用量增加能缓解一定的镉毒害作用。相同氯化钙和石灰处理下，0.6 mg/kg镉胁迫处理的三七株高较未经镉处理的高，表明低Cd胁迫能显著增加三七幼苗株高和生物量，与吴桂容等[27]研究一致。在镉胁迫下，施用氯化钙和石灰时，三七植株MDA含量反而上升，可能是由于氯化钙和石灰反而促进了镉对植物的毒害作用，氯化钙和石灰浓度越高，促进作用越明显，但对于抗氧化酶来说，在镉胁迫下，随着氯化钙和石灰浓度上升，抗氧化酶活性降低，越有利于植物生长。

结果表明，无镉胁迫处理和0.6 mg/kg镉胁迫处理时，施用高浓度的石灰使三七的MDA含量升高。李贺的研究发现，高浓度的钙对大蒜有不利的影响，使得 CAT 和 POD 等防御酶活性降低[28]。龚小敏[29]探究外源钙对镉胁迫下作物的影响中也发现相似的规律。在镉胁迫条件下，2种含钙物质同浓度下对三七细胞抗氧化酶和三七植株镉含量的积累响应各异，同一镉胁迫下，施用相同钙浓度的石灰和氯化钙，石灰处理后三七植株的镉含量低于氯化钙处理。