阿司匹林磷脂复合物脂微球的制备及评价*

贺智勇， 姜丰， 李婉蓉， 杨佳佳， 周雪， 吴林菁， 肖婷， 沈祥春， 陶玲

(贵州医科大学， 贵州省天然药物资源高效利用工程中心， 贵州省高等学校天然药物药理与成药性评价特色重点实验室， 贵州医科大学贵阳市联合重点实验室， 天然药物资源优效利用重点实验室， 贵州 贵阳 550025)

近年来，血栓性疾病上升趋势迅猛，严重威胁人类的生命健康，是当代医学研究的重点和热点之一。研究表明，血管内皮损伤是形成血栓的主要原因[1]。阿司匹林(asprin，ASP)在临床应用已有上百年的历史，30年来小剂量服用ASP广泛用于抑制血小板凝集、可有效预防由血栓引发的心脑血管疾病[2]，并在抗肿瘤[3]、抑制动脉粥样硬化[4]、抑制心肌纤维化中有防治作用[5]，在抑制肺间质纤维化[6]等方面也体现较好疗效。但ASP对胃肠道具有显著的刺激作用，甚至伴随有胃出血的风险。脂微球(lipid microspheres，LM)是一种将药物溶解或者分散在脂肪油中，以脂肪油为软基质并被磷脂膜包封的微粒分散体系[7-11]，具有靶向性、缓释性等作用，特别是可以选择性蓄积于血管内皮损伤部位。 本研究前期成功制备了阿司匹林磷脂复合物(ASP-PC)，在此基础上进行阿司匹林磷脂复合物脂微球(ASP-PC-LM)的制备研究，以期为心脑血管疾病药物提供更多的递送系统参考。

1 仪器与材料

1.1 药品与试剂

阿司匹林(阿拉丁试剂上海有限公司，批号D1316056，纯度99%)，阿司匹林磷脂复合物(自制)，15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯(Killiphor HS 15徳国巴斯夫公司，批号0339458800)，注射用大豆磷脂(上海太伟药业有限公司，磷脂酰胆碱含量≥90%，批号20140702)，辛癸酸甘油酯(MCT，上海佑创实业有限公司)，橄榄油(国药集团化学试剂有限公司，批号20131703)，油酸(国药集团工业股份有限公司，批号20131126)。

1.2 主要仪器

BT-9300H型激光粒度分布仪(丹东百特仪器有限公司)，80-2型低速离心机(上海手术器械厂)，PHD D-3L型高压均质机(美国PHD科技有限公司)，NANOJ H10型高速剪切乳化机(ATS工业系统有限公司)，电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)，1290型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，Delsa Nano Zeta型电位及纳米粒度分析仪(英国马尔文公司)。

1.3 方法

1.3.1色谱条件 Ultimate®UHPLC AQ-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流速0.5 mL/min，进样量0.5 μL，柱温40 ℃，检测波长276 nm和303 nm，流动相为乙腈-冰醋酸-四氢呋喃-水(20∶5∶5∶70)。

1.3.2ASP和水杨酸(salicylic acid,SA)含量测定方法学的建立 SA对照品溶液的配制：精密称取SA对照品15.1 mg，置于50 mL的容量瓶中，加入1%的冰醋酸甲醇溶解并定容，配制成浓度为302 mg/L的SA对照品储备液。ASP对照溶液的配制：精密称取ASP对照品15.1 mg，置于50 mL的容量瓶中，加入1%的冰醋酸甲醇溶解并定容，配制成浓度为302 mg/L的ASP对照储备液。供试品溶液的配制：精密称取按照最优处方制备的ASP-PC-LM适量，置于10 mL的容量瓶，加1%冰醋酸甲醇稀释并定容。空白对照溶液的配制：精密称取最优处方量的空白辅料，置于10 mL的容量瓶，加1%冰醋酸甲醇稀释并定容。

1.3.3方法学考察 (1)专属性试验：精密吸取上述ASP对照品溶液，SA对照品溶液，空白溶液和供试品溶液各0.5 μL进样分析，记录色谱图。(2)线性关系的考察：精密吸取ASP对照品溶液，配制成浓度分别为15.1、30.2、60.4、120.8、181.2、241.6 mg/L的标准溶液，按1.3.1项下色谱条件测定；精密吸取SA对照品溶液，配制成浓度分别为15.1、30.2、60.4、120.8、181.2、241.6 mg/L的标准溶液，同法操作。(3)精密度试验：分别精密吸取中浓度(120.8 mg/L )ASP标准溶液和中浓度(181.2. mg/L)SA标准溶液，连续进样测定6次，记录峰面积，计算RSD值。(4)重复性试验：精密吸取低(30.2 mg/L)、中(60.4 mg/L)、高(120.8 mg/L)浓度项下的ASP标准溶液以及低(30.2 mg/L)、中(60.4 mg/L)、高(120.8 mg/L)浓度项下的SA标准溶液，分别连续测定3次，记录峰面积，计算RSD值。(5)稳定性试验：分别精密吸取中浓度(120.8 mg/L)ASP标准溶液和中浓度(121.2 mg/L)SA标准溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定其峰面积，计算日内RSD值。(6)加样回收率试验：在回收率试验中，按主药含量质量分数的80%、100%、120% 取ASP和SA对照品各3份，加入空白脂微球递送系统，计算平均回收率和RSD值。

1.3.4包封率的测定 取5 mL的ASP-PC-LM至超滤管中，采用截留分子量为3 kDa的超滤膜，3 000 r/min离心15 min，收集滤液，直接进样分析，计算游离药物含量，并计算包封率，公式如下。

×100%

1.3.5离心稳定性测定 取最优处方制备的3批ASP-PC-LM，置于15 mL的离心管中，3 000 r/min离心10 min，用微量移液器取试管底部澄清液体100 μL，置于25 mL量瓶，蒸馏水稀释并定容，用紫外分光光度计在500 nm处测定吸光度值A，同法将未离心的乳剂定容离心后，在相同波长处测定吸光度值(A0)，计算离心稳定常数(Ke)，计算公式如下为Ke=(A0-A)/A0×100%。

1.4 ASP-PC-LM的制备

取处方量的ASP-PC溶于一定体积的有机溶剂中，再将处方量的油相，磷脂，稳定剂，预热至于70℃。高速剪切分散至全部溶解，得油相；将亲水性的表面活性剂分散于同温度的高纯水中，得水相；将水相缓慢加入到油相当中，高速剪切机剪切一定时间后，再移至高压均质机中，均质一定时间和次数，得ASP-PC-LM。

1.4.1处方筛选 (1)油相种类的考察：确定ASP-PC为138 mg(相当于投药量为ASP 30 mg)、0.3%的油酸、1.2%的大豆磷脂和2.0%的Kolliphor®HS 15，乳化温度为70 ℃，乳化时间为5 min，高速剪切速度为10 000 r/min，均质压力为110 Ma，均质次数为3次，以Ke和平均粒径为评价指标，固定两种混合油相MCT ∶大豆油和MCT ∶橄榄油均为1 ∶1，分别称取10%的两种混合油相进行制备考察。(2)油相用量的考察：参照(1)考察条件，以Ke和平均粒径为评价指标，考察MCT ∶橄榄油为1 ∶1的混合油相用量分别为10%，15%，20%和30%对于ASP-PC-LM制备的影响。(3)混合油相比例的考察：参照(2)考察条件，以Ke和平均粒径为评价标准，考察油相中MCT和橄榄油的比例为1 ∶1和2 ∶1，3 ∶1和1 ∶2时对ASP-PC-LM制备的影响。(4)水相表面活性剂Kolliphor®HS 15用量的考察：参照(3)考察条件，以Ke和平均粒径为评价标准，考察水相表面活性剂Kolliphor®HS 15用量为1.5%，2.0%，2.5%和3.0%对ASP-PC-LM制备的影响。(5)稳定剂种类的考察：参照(4)考察条件，以Ke和平均粒径为评价标准，考察稳定剂种类为油酸、油酸钠、胆固醇对ASP-PC-LM制备的影响[12]。

1.4.2工艺考察 (1)初乳剪切速度的考察：参照1.4.1处方最优条件，以Ke和平均粒径为评价标准，考察剪切速度为10 000 r/min、13 000 r/min、16 000 r/min、19 000 r/min对ASP-PC-LM制备的影响。(2)初乳剪切时间的考察：参照(1)考察条件，以Ke和平均粒径为评价标准，考察初乳乳化时间分别为3 min、5 min、7 min和9 min对ASP-PC-LM制备的影响。(3)高压均质压力的考察：参照(2)考察条件，以Ke和平均粒径为评价标准，考察均质压力分别为70 MPa、90 MPa、110 MPa和120 MPa对ASP-PC-LM制备的影响。(4)高压均质次数的考察：参照(3)考察条件，以Ke和平均粒径为评价标准，考察均质次数分别为5次、7次和9次对ASP-PC-LM制备的影响。

1.4.3最佳处方工艺验证 根据单因素试验结果，得最佳处方工艺条件，即得ASP-PC-LM，同法制备3份，测定Ke和平均粒径、包封率。

1.5 ASP-PC-LM的药剂学性质考察

1.5.1外观形态观察 取最优处方制备的ASP-PC-LM，目测其外观，颜色以及流动性；然后用超纯水稀释分散均匀，滴至附有支持网膜的铜筛网上，用体积分数为2%的磷钨酸负染色，用滤纸吸走多余的液体，室温下自然干燥后于透射电镜下观察，并拍照，观察脂微球的物理形态。

1.5.2粒径和Zeta电位 取最优处方制备的ASP-PC-LM，纯化水稀释，25 ℃条件下，采用激光粒度分析仪及Zeta电位测定平均粒径及其粒径分布、Zeta电位。

1.5.3初步稳定性考察 将最优处方制备的ASP-PC-LM，置于室温(25 ℃)和4 ℃下，分别于0、1、3和5 d后，取样，观察外观，测定其粒径和包封率，并比较其变化；并于48 h内于-20 ℃和25 ℃条件下冻融循环3次，同法观察。

2 结果

2.1 ASP-PC-LM含量测定

(1)专属性试验：图1显示空白溶液在ASP和SA相应出峰时间无吸收峰，对测定无干扰，ASP、SA与辅料峰分离度良好。(2)线性关系的考察：以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制ASP标准曲线得A=0.405 8c-1.368 0，r=0.999 8，表明ASP质量浓度在15.1～241.6 mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系；同法操作，绘制SA标准曲线得A=1.412c-2.280 6，r=0.999 9，表明SA质量浓度在15.1～241.6 mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系。(3)精密度试验：计算得RSD分别为0.72%和0.82%，表明仪器精密度良好。(4)重复性试验：ASP标准溶液低，中，高浓度下的RSD值为0.54%，1.69%和1.55%，SA标准溶液RSD值分别为0.79%、0.66%及0.45%，表明该方法重复性良好，符合要求。(5)稳定性试验：ASP和SA标准溶液RSD值为2.44%和0.92%，表明药物溶液在12 h内稳定性良好。(6)加样回收率试验：ASP平均回收率为99.60%(n=9)，RSD为0.90%，SA平均回收率为100.09%(n=9)，RSD为0.60%，表明该方法回收率符合要求。

图1 对照品及样品的HPLC色谱结果Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance and sample

2.2 ASP-PC-LM的制备

2.2.1处方的考察 随着油相用量的增加，粒径和离心稳定常数均呈先下降后上升的趋势，当橄榄油和MCT以1∶1混合作为油相，且油相用量为15%时，平均粒径和离心稳定常数最小；随着乳化剂用量的增加，粒径呈先下降后升高的趋势，故选择乳化剂用量较少的2.0%为最佳；采用油酸为稳定剂时，粒径最小。见表1。

2.2.2工艺考察 当剪切速度为10 000 r/min；初乳剪切时间为5 min，均质压力为110 MPa时，粒径和离心稳定常数均较小；随着高压均质次数的增加，粒径有所增加但不明显，考虑到仪器设备的损耗，选择较小的均质次数来得到最佳的均质结果，因此选择均质次数为3次。见表2。

2.2.3最佳处方工艺验证 所得最佳处方工艺条件为ASP-PC为138 mg(投药量相当于ASP为30 mg)，油相为MCT∶橄榄油=1∶1，用量为15%，乳化剂为大豆磷脂1.2%，稳定剂为油酸0.3%，预热至70 ℃，得油相；Kolliphor®HS 15用量为2%，分散于同温度的注射用水中，得水相；将水相缓慢加入到油相当中，乳化时间为5 min，剪切速度为10 000 r/min，得初乳，再进行高压均质，均质压力为110 MPa，均质次数为3次，即得ASP-PC-LM。测定结果见表3。

表1 处方考察结果Tab.1 The investigation results of formulation

表2 工艺考察结果Tab.2 The investigation results of process

表3 最佳处方工艺考察结果Tab.3 The inspection results of optimum formulation process

2.3 ASP-PC-LM的药剂学性质考察

2.3.1外观形态观察 3批最优处方制备的ASP-PC-LM，肉眼观察外观为乳白色，流动性良好。透射电镜观察结果表明ASP-PC-LM乳滴性状，呈球形或者类球形，分布均一。见图2。

图2 ASP-PC-LM透射电镜图(15 000×)Fig.2 Transmission electron microscopy of ASP-PC-LM

2.3.2粒径和Zeta电位 ASP-PC-LM的平均粒径为(180.2±12.8)nm，多分散系数为0.136±0.066，粒径范围较小，Zeta电位为(-41.23±1.53)mV，为热力学稳定体系。见图3和4。

图3 ASP-PC-LM累积粒径分布Fig.3 The accumulative total about particle size distribution of ASP-PC-LM

图4 ASP-PC-LM的Zeta电位Fig.4 Zeta potential of ASP-PC-LM

2.3.3初步稳定性考察 ASP-PC-LM在48 h内冻融循环(-20～25)℃ 3次，未出现分层现象；ASP-PC-LM在置于室温(25 ℃)和4 ℃条件下，于0、1、3和5 d后观察，其外观均呈乳白色，未见分层，但室温(25 ℃)条件下粒径和包封率变化明显，而在4 ℃条件下放置5 d后，粒径和包封率变化均较小，说明ASP-PC-LM更适宜在此条件下短期储存，但考虑其仍有粒径增大和包封率下降的趋势，因此后期考虑进行冷冻干燥工艺的考察以期进一步提高稳定性。

3 讨论

脂质材料制备的纳米递送系统成为研究的热点，但是对于水溶性强的药物，具有载药量和包封率低的缺点，前期研究表明，单独的ASP不论在固体脂质材料，还是液体脂质材料中，载药量和包封率都较差。本研究采用磷脂复合物能改善药物油水分配系数的特点，在制备具有良好脂溶性的ASP-PC基础上，进行脂微球递送系统研究，成功制备了ASP-PC-LM，为脂溶性差的药物脂质材料递送系统研究提供了一定参考。

在进行油相种类的考察时，根据实验室前期对ASP-PC在大豆油、MCT和橄榄油3种油中的溶解度结果可知，ASP-PC在MCT中的溶解度相对较高，在橄榄油和大豆油当中的溶解度相近。随着 MCT 量的增加，乳剂的粒径逐渐减小，可能由于MCT 的黏度较 LCT小，易分散。由于MCT大量摄入，进入体内透过血脑屏障会产生神经衰弱的副作用，因此考虑将MCT和大豆油、橄榄油分别进行配比考察，结果表明，MCT和橄榄油混合作为油相时，Ke和粒径都优于MCT和大豆油配比。在进行油相用量考察时，用量为10%和15%粒径和稳定性差别不大，但油相用量增加可以增加载药量和包封率，因此选择油相用量为15%。脂微球常用的稳定剂有油酸和油酸钠。本研究中发现，加入稳定剂油酸钠，剪切分散后初乳粒径较大，很快分层，可能由于油酸钠水溶性太强，很难附着在油水界面膜上，故只选用油酸作为稳定剂。高速剪切速度和时间均为影响粒径和稳定性的重要因素，本实验中，时间的影响更大，剪切过快或者剪切时间太长都不利于粒子的稳定；另外，高速剪切制得的初乳球形均一性差，粒径范围较大。采用高压匀质法，利用空穴效应、撞击效应、剪切效应等可使初乳进一步完成分散、乳化、均质等工艺过程，使脂微球平均粒径减小至200 nm左右，粒度分布范围更小[13-15]。