TSC1转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究

王 红，蒋 莉，王 岩，许振凯，王威平，方 航， 孙 鹏,白晓春1，2，3，*

(1.南方医科大学附属第三医院，广东 广州510630；2.广东省骨科研究院，广东 广州510630；3.广东省骨科医院，广东 广州510630；4.吉林大学第一医院 急诊科，吉林 长春130021；5.吉林大学中日联谊医院科学研究中心，吉林 长春130033；6.南方医科大学，广东 广州510515；7.中山大学肿瘤防治中心麻醉科，广东 广州510060；8.华南肿瘤学国家重点实验室广东 广州510060；9.肿瘤医学省部共建协同创新中心，广东 广州510060)

结节性硬化复合物1(Tuberous sclerosis complex1,TSC1)，是人类的一种抑癌基因，与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(The mammalian target of rapamycin，mTOR)有着密切的联系。目前研究发现，mTOR能整合细胞内外各种信号，是机体与细胞感受营养的信号通路[1]。TSC1位于mTOR信号通路的上游，对mTOR有一定抑制作用。既往研究主要集中mTOR信号通路对心脑疾病及肿瘤发病机制的探讨，而近期实验发现mTOR信号通路在骨骼发育过程中发生变化[2,3]，但机制仍未阐明。骨骼发育过程中，肢芽干细胞、软骨细胞及成骨细胞是其主要构成部分，阐明3者与mTOR信号通路的关系，将为骨骼发育提供新视野。

本研究拟构建肢芽干细胞特异性TSC1敲除小鼠(Prx-1-Cre；TSC1flox/flox)、软骨细胞特异性TSC1敲除小鼠(Col2a1-Cre；TSC1flox/flox)、成骨细胞特异性TSC1敲除小鼠(Osx-Cre；TSC1flox/flox)，为进一步研究mTOR信号通路调控骨骼发育的机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：TSC1-loxP小鼠(品系号：005680)、Prx-1-Cre小鼠(品系号：006361)和Osx-Cre小鼠(品系号：006361)均购自美国的The Jackson Laboratory。不可诱导Col2a1-Cre小鼠(品系号：003554)为军事医学科学院赠与。用于保种繁殖和阶段性年龄相关的野生型黑背景C57BL/6小鼠，均购自南方医科大学实验动物中心。主要材料：琼脂果糖、GelRed等。

1.2 方法

1.2.1小鼠繁殖与分组 在SPF级动物饲养室繁殖小鼠，温度控制在25°左右，湿度保持70%左右。首先利用不可诱导Col2a1-Cre小鼠和TSC1-loxP小鼠交配，繁殖出携带有杂合Col2a1-Cre和杂合TSC1-loxP位点的小鼠，基因型为TSC1flox/-Col2a1-Cre的F1代小鼠。待小鼠成年后，继续与TSC1-loxP小鼠交配，繁殖出杂合Col2a1-Cre和纯合TSC1-loxP位点的小鼠，基因型为带Col2a1-Cre的TSC1flox/flox的F2代纯合子小鼠，此为软骨细胞特异性敲除TSC1转基因小鼠(Col2a1-Cre；TSC1flox/flox)。 同窝带Col2a1-Cre的TSC1flox/flox小鼠分组为Col2a1-TSC1 CKO组，正常的小鼠(如Col2a1-Cre；TSC1flox/-，TSC1flox/flox)分组为正常组(Con组)。

用以上的繁殖方法可获得带Prx-1-Cre的TSC1flox/flox纯合子小鼠、带Osx-Cre的TSC1flox/flox纯合子小鼠，并分组为Prx-1-TSC1 CKO组、Osx-TSC1 CKO组。

小鼠基因型鉴定引物序列：

Prx-1-Cre primer forward:5′-TCCAATTTACTGACCGTACACCAA-3′

Prx-1-Cre primer forward:5′-CCTGATCCTGGCAATTCGGCTA-3′

Col2a1-Cre primer forward:5′-GCATCGACCGGTAATGCAGGC-3′

Col2a1-Cre primer reverse:5′-GAGGGTCCAGCCCGAGCTACTT-3′

Osx-Cre primer forward:5′-CTCTTCATGAGGAGGACCCT-3′

怎么会是这样呢？紫云一脸错愕，掩面冲出办公室，跟呆立在门外的水仙芝撞了一个满怀。两人先是一惊，不觉同时笑起来了。

Osx-Cre primer reverse:5′-GCCAGGCAGGTGCCTGGACAT-3′

TSC1 loxP primer up：5′-GTC ACG ACC GTA GGA GAA GC-3′

TSC1 loxP primer down：5′-GAA TCA ACC CCA CAG AGC AT-3′

反应体系的配置如下：

2×PCR mix10 μl上游引物 02 μl下游引物02 μl超纯水02 μlDNA模板04 μl总体积20 μl

PCR反应程序：

Col2a1-Cre程序：①94℃ 3 min；②94℃ 40sec；③ 65℃ 40sec；④72℃ 1 min；⑤72℃ 2 min；⑥10℃ hold。②到④为循环反应，循环数为37

TSC1 loxP程序：①94℃ 3 min；②94℃ 40sec；③65℃ 1 min；④72℃ 1 min；⑤72℃ 2 min；⑥04℃ hold。②到④为循环反应，循环数为35

Osx-Cre程序：①94℃ 2 min；②94℃ 30sec；③60℃ 30sec；④72℃ 30sec；⑤72℃ 2 min；⑥04℃ hold。②到④为循环反应，循环数为35

Prx-1-Cre程序：①94℃ 3 min；②94℃ 30sec；③60℃ 1 min；④72℃ 1 min；⑤72℃ 2 min；⑥04℃ hold。②到④为循环反应，循环数为35

琼脂糖凝胶电泳鉴定基因：吸取7-8 μl样品加入琼脂糖凝胶上样孔中，常温下恒压160V 电泳约15-20 min，紫外投射仪下观察并拍照。

1.2.3免疫组化 在出生后8周处死小鼠后取胫腓骨标本，固定并用石蜡包埋后，制作成石蜡切片，收集的新鲜组织标本石蜡切片，进行一抗p-S6过夜孵育，二抗37度孵育1 h，DAB显色观察。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 转基因小鼠大体外观及体长分析

各转基因小鼠繁殖比较顺利，均获得相应的带Cre的TSC1纯合小鼠。Prx-1-TSC1 CKO组与Con组相比，Prx-1-TSC1 CKO组小鼠瘦小。Col2a1-TSC1 CKO组与Con组相比，Col2a1-TSC1 CKO组小鼠弓形驼背。Osx-TSC1 CKO组与Con组相比，Osx-TSC1 CKO组呈方颅畸形(图1)。

A为转基因小鼠繁殖策略；B为8周龄大小鼠的大体外观。(放大倍数为10X和40X)

2.2 转基因小鼠的鉴定分析

RT-PCR实验基因鉴定结果：图2为出生后3周各小鼠的基因鉴定结果。1号为带Prx-1-Cre的TSC1flox/ flox纯合子；2号为不带Prx-1-Cre的TSC1flox/flox纯合子；3号为不带Prx-1-Cre的TSC1flox/-杂合子；4号为带Prx-1-Cre的TSC1flox/-杂合子；5号、6号为不带Col2a1-Cre的TSC1flox/flox纯合子；7号为带Col2a1-Cre的TSC1flox/-杂合子；8号为带Col2a1-Cre的TSC1flox/flox纯合子；9号、11号为带Osx-Cre的TSC1flox/-杂合子；10号为带Osx-Cre的野生型小鼠；12号为带Osx-Cre的TSC1flox/flox纯合子。

图2 小鼠基因DNA及Cre重组酶的PCR鉴定结果

RT-PCR实验结果显示：TSC1-loxP的PCR产物为230 bp和193 bp，TSC1纯合子只有230 bp条带，野生型小鼠则只有193 bp条带，而杂合子则有230 bp和193 bp 条带。Prx-1-Cre的PCR产物为550 bp条带，Col2a1-Cre的PCR产物为358 bp条带，Osx-Cre的PCR产物为430 bp条带(图2)。

2.3 转基因小鼠软骨与骨组织的免疫组化分析

取8周龄大的小鼠膝关节进行免疫组化p-S6染色。Prx-1-TSC1 CKO组与Con组相比，其p-S6的主要表达位置集中在关节软骨面的软骨细胞和软骨下骨骨小梁的成骨细胞，而且明显升高。Col2a1-TSC1 CKO组与Con组相比，其p-S6的主要表达位置集中在关节软骨面的软骨细胞，而且明显升高。Osx-TSC1 CKO组与Con组相比，其p-S6的主要表达位置集中在髓腔骨小梁的成骨细胞，而且明显升高(*，P<0.05；**，P<0.01)(图3)。

3 讨论

正常情况下，骨骼发育过程是需要多种细胞参与，如间充质干细胞、软骨细胞、成骨细胞等。其中间充质干细胞早期可分化成肢芽干细胞，在骨骼形成中有着密切关系，是修复骨缺损的重要细胞来源。软骨内成骨的过程中，间充质细胞或者肢芽干细胞形成致密体，致密体内细胞分化为软骨细胞，然后软骨细胞开始停止增殖，表达肥大软骨细胞特异性表达的X型胶原，后分化为成骨细胞，使之分泌骨基质，最终形成骨领[4]。在此过程中，如肢芽干细胞发育异常，则直接影响骨骼发育，导致身体机能严重受限。如软骨细胞发育异常，则发生软骨发育不全，导致侏儒症或者骨关节炎[5]。如成骨细胞发育异常，则发生骨质疏松症或者脆骨病等[6]。mTOR是一个调节细胞生长与代谢的信号通路，参与调节蛋白合成、细胞生长、分化、增殖及凋亡[7,8]。其对骨骼发育的重要作用[9]已逐渐成为研究的热点。但是，大多数的研究结果均得不到一致的结果，甚至互相矛盾，对其发育机制仍有争议。有些观点认为，mTOR信号通路是促进成骨分化[10]；而黄彬[11]等认为，mTOR信号通路是促进成骨增殖，抑制成骨分化。在我们的研究中，不管在软骨细胞，还是成骨细胞，Con组小鼠的mTOR活性均比Prx-1-TSC1 CKO组、Col2a1-TSC1 CKO组、Col2a1-TSC1 CKO组小鼠明显降低，说明在正常情况骨发育过程下，mTOR活性保持低表达；而mTOR活性高表达，则引起相应的骨骼疾病，如侏儒症、方颅畸形等。因此，从肢芽干细胞、软骨细胞、成骨细胞上探讨mTOR信号将成为结果骨骼发育异常的新策略。

Cre/loxP系统是目前应用较多的基因敲除模型，在国内外已经得到广泛推广。该系统主要由Cre重组酶和loxP位点组成，Cre重组酶具有一定的催化活性，并且与限制酶有一定相似之处，能识别特定的DNA序列，如loxP位点，引起内外源基因敲除、失活、激活、插入、倒转、易位等[12,13]。在肢芽干细胞、软骨细胞、成骨细胞上敲除TSC1基因，将有望构建肢芽干细胞、软骨细胞、成骨细胞mTOR活性激活的转基因小鼠，对研究骨骼发育异常提供良好的动物模型。按照转基因繁殖方法[14]，我们得到了相应的Prx-1-TSC1 CKO组、Col2a1-TSC1 CKO组和Col2a1-TSC1 CKO组小鼠各8只，其敲除效果明显： Prx-1-TSC1 CKO组集中在关节软骨和软骨下骨骨小梁；Col2a1-TSC1 CKO组，集中在关节软骨，引起脊柱弓形驼背；Osx-TSC1 CKO组，集中在髓腔骨小梁，引起方颅畸形。

图3 转基因小鼠的p-S6分布结果

A为Prx-1-TSC1 CKO组与Con组小鼠的关节软骨和软骨下骨p-S6的表达，B、C分别为其关节软骨、骨小梁p-S6表达统计分析；D为Col2al-TSC1 CKO组与Con组小鼠的关节软骨p-S6的表达，E为其关节软骨p-S6表达统计分析。F为Osx-TSC1 CKO组与Con组小鼠的髓腔骨小梁p-S6的表达，G为其骨小梁p-S6表达统计分析。(放大倍数为200X和400X)

综上所述，本实验中成功构建了肢芽干细胞、软骨细胞、成骨细胞特异性敲除TSC1转基因小鼠，首次从骨骼发育各阶段中繁殖出相应的mTOR活性激活小鼠，为进一步探讨骨骼发育缺陷提供新的研究靶点和新认识，为临床骨科相关疾病提供新的理论基础。