穿心莲内酯对镉致小鼠急性肝损伤的改善作用

何亚兰， 朱耀辉， 陈 超， 洪敏影， 张 晨， 王 楠， 刘 畅， 李 磊

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

重金属镉(Cd)是一种对人体危害极大的毒物，其移动性大，毒性强，半衰期长达10～30年，被美国毒物管理委员会列为第6位危及人类健康的有毒环境污染物质[1]。环境镉污染主要来源于锌矿、铅矿等的开采与冶炼，化石燃料的应用以及机械制造等生产领域。进入环境中的镉可通过食物链富集进入人体，对人体肾脏、肝脏、肺脏、骨骼、大脑以及生殖、免疫系统等均可造成损伤[2]，并具有致畸、致癌、致突变的作用，其中肝脏是镉急性毒性的主要靶器官[3]。目前针对镉中毒的治疗常采用鳌合剂、营养元素、维生素类药物，虽能起到一定治疗作用，但也都存在着不同程度的不良反应[4]。所以,寻求一种更为有效的、副作用小的药物预防或治疗镉中毒日趋成为研究热点。

穿心莲内酯(andrographolide，Andro)为天然药物穿心莲的有效成分，具有抗菌、抗炎、免疫调节、保肝利胆等作用[5]，并且毒性小、价格低[6]。相关研究表明Andro可通过抗炎及抗氧化作用缓解乙醇、四氯化碳导致的肝毒性[7-8]，然而,目前有关于Andro缓解镉诱导肝损伤的研究尚未见报道。为此，本研究观察Andro对镉致急性肝损伤的缓解作用，以期为Andro临床应用于治疗镉诱导的急性肝毒性提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 体重18～22 g清洁级ICR小鼠30只，由安徽科技学院实验动物中心提供。试验期间自由采食、饮水。

1.1.2 药品与试剂 Andro(批号：C10064882)购于上海麦克林生化科技有限公司；CdCl2(批号：E1724020)购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羧甲基纤维素钠(批号：F20050621)购于国药集团化学试剂有限公司；天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)试剂盒(批号：20180511),谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)试剂盒(生产批号：20180511),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒(批号：20180512)和还原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)测定试剂盒(批号：20180512)均购于南京建成生物工程研究所；小鼠肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β ELISA试剂盒购于深圳欣博盛生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自于美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.1.3 仪器设备 电热恒温培育箱(上海一恒科学仪器有限公司)；全波长酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；IMS-70全自动雪花制冰机(常熟市雪科电器有限公司)；第三代高速组织研磨器套装(天根生化科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 分组及给药 取30只清洁级ICR小鼠适应性喂养一周后，随机分为空白对照组、模型组、Andro低剂量组(30 mg/kg)、Andro高剂量组(60 mg/kg)。空白对照组和模型组每日按0.1 mL/10 g给予0.5%羧甲基纤维素钠，给药组分别给予相应剂量的Andro，连续灌胃7 d，期间小鼠自由采食和饮水。第7天灌胃2 h后，对模型组和Andro给药组腹腔注射4 mg/kg CdCl2，18 h后处死小鼠。

1.2.2 样品采集 摘眼球取血，于室温静置1～2 h后4 ℃条件下4 000 r/min离心15 min分离血清，收集肝脏，-80 ℃超低温冷冻储存用于后续试验。

1.3 指标检测

1.3.1 血清生化指标的检测 将分离的血清,按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书测定小鼠血清ALT与AST的活力。

1.3.2 肝脏组织病理学检查 摘取小鼠左肝叶片，经4%甲醛固定，用乙醇脱水，石蜡包埋，冷却并切片，伊红-苏木精(H&E)染色，光镜下观察肝细胞病理学变化。

1.3.3 肝脏抗氧化指标的检测 准确称取肝脏100 mg，加入9倍体积的生理盐水，置于冰上研磨粉碎，制成10%肝脏匀浆液，2 500～3 000 r/min离心10 min，取上清，按照说明书操作检测小鼠肝脏GSH含量与SOD的活力，以样本蛋白浓度进行校正。

1.3.4 血清炎症因子的检测 按照ELISA试剂盒说明书步骤检测TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。首先样品加入反应孔，于37 ℃反应90 min。洗板5次，加入生物素化抗体工作液，37 ℃反应30 min。洗涤后再加酶结合物工作液，混匀，37 ℃反应30 min。然后加入显色剂避光显色15 min，最后添加终止液终止反应，450 nm处测定吸光值，以同次试验标准品所绘标准曲线计算其含量。

1.4 数据统计

使用SPSS statistics 23.0软件处理数据，采取单因素ANOVA分析，多重比较采用LSD检验，数据结果均以“平均值±标准误”表示；P<0.05表示显著差异，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 小鼠血清生化指标

Andro对镉致肝组织损伤小鼠血清转氨酶水平的影响(表1)。与空白对照组相比，CdCl2模型组小鼠ALT、AST活力明显上升(P<0.01)，提示小鼠肝损伤模型建立成功。Andro低剂量组(30 mg/kg)和高剂量组(60 mg/kg)均可使ALT、AST活力显著降低(P<0.01)。

表1 Andro对镉致肝损伤小鼠血清转氨酶活力的影响

注：**表示与空白组比较P<0.01；#表示与模型组比较P<0.05;##表示与模型组比较P<0.01。下同。

2.2 对小鼠肝组织病理学影响

空白对照组小鼠肝细胞排列整齐，肝小叶结构完整，肝窦正常，细胞核结构清晰，无病理变化(图1A)；CdCl2模型组小鼠肝窦分散，肝索边界模糊，肝细胞出现空泡和坏死(图1B)；使用Andro可改善CdCl2引起的小鼠肝组织细胞形态变化(图1C，图1D)。

图1 Andro对镉致急性肝损伤小鼠肝组织病理学影响(HE×200)

2.3 对肝脏抗氧化指标的影响

Andro对镉致急性肝损伤小鼠抗氧化指标的影响(表2)。与空白对照组相比，模型组可显著提高肝组织SOD活力和GSH含量(P<0.01)。不同剂量Andro均可使SOD活力和GSH含量有所升高。

表2 Andro对镉致急性肝损伤小鼠抗氧化指标的影响

2.4 对血清炎性细胞因子表达的影响

Andro对镉致急性肝损伤小鼠血清炎性细胞因子表达的影响(表3)。与空白对照组相比，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显上升(P<0.01)。各给药组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均极显著低于模型组(P<0.01)。

表3 Andro对镉致急性肝损伤小鼠血清炎性细胞因子表达的影响

3 结论与讨论

肝脏是镉蓄积的主要器官，镉的蓄积可导致肝细胞坏死、凋亡、自噬和恶变等[9]。越来越多的证据表明，炎症反应和氧化应激在镉诱导的肝毒性中发挥着重要的作用[10]。当肝脏损伤时，其细胞膜结构和通透性发生改变，肝脏细胞中的ALT、AST进入血液，使得血清转氨酶水平升高。本研究中，ICR小鼠腹腔注射4 mg/kg的CdCl218 h后其血清中ALT和AST的活性显著升高(P<0.01)，实验结果与吴永琴等的文献报道相一致[11]。提示CdCl2诱导的急性肝损伤模型造模成功。而Andro处理组(30、60 mg/kg)可显著降低模型组的ALT、AST活性；此外，肝组织病理学结果显示，Andro处理组肝组织损伤程度较模型组有所减轻，表明Andro对CdCl2诱导的小鼠急性肝损伤具有改善作用。

研究表明，急性镉中毒时，机体的抗氧化系统遭到破坏，对脂质过氧化物的代谢能力被削弱，导致膜脂质的过氧化作用增强，进而造成了肝脏的氧化损伤[12-13]。SOD作为体内主要的抗氧化酶之一，能够消除机体在代谢过程中产生的O2-自由基，抑制脂质过氧化作用，减少细胞损伤[14]。因此，SOD活力的检测可以直接反映机体的抗氧化能力。GSH是肝脏中重要的抗氧化剂，能清除自由基，对肝脏起到保护作用[15]。本研究发现，Andro能增加GSH含量和SOD活力，表明Andro具有调节机体抗氧化功能起到改善CdCl2诱导的小鼠急性肝损伤的作用。

炎性细胞因子参与机体免疫应答、免疫调节及细胞的调亡等过程，在机体的各种生理和病理过程扮演着重要的角色。研究表明，在镉诱导急性肝损伤过程中，肝非实质细胞，尤其是枯否氏细胞表达和分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6是镉介导肝毒性的重要因素之一。研究表明，染镉小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6均显著升高。本研究结果发现，Andro可显著降低染镉小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，说明Andro可能通过影响炎性细胞因子的表达改善CdCl2诱导的小鼠急性肝损伤。

综上所述，Andro的应用能够有效改善镉诱导的小鼠肝损伤，这与其缓解肝脏氧化损伤与炎症反应有关，但Andro改善镉致急性肝损伤的确切作用机制还需要进一步研究。