BenchMark Special Stains全自动染色机与手工方法在肾脏PAS染色中的比较

杨眉 雷松 陈昱 罗添友

（四川大学华西医院病理科 四川 成都 610041）

过碘酸雪夫染色（PAS染色）是肾穿刺活检病理常用的组织化学染色之一，主要用于显示肾小球系膜区范围和基底膜的厚度，也可显示肾小球内某些渗出性蛋白、节段性硬化和结节性病灶[1-2]。手工染色易受人为环境因素影响，质量不易控制。我科引进全自动特殊染色机一年多来，已做肾脏PAS染色1400余例取得良好效果，现介绍如下。

1.材料与方法

1.1 石蜡组织标本

随机选取四川大学华西医院病理科2018年6月肾脏穿刺标本30例，其中本院15例、外院标本15例。

1.2 仪器与试剂

BenchMark Special Stains全自动特殊染色机，PAS Stain Kit染液套装（包括PAS PERIOD.ACID，PAS HEMATOXYLIN，PAS NEUTRALIZER，PAS SCHIFFS）、脱蜡液、清洗液、液体封盖油膜。手工染色试剂均由科室自行配置。

1.3 样本制备

肾脏穿刺组织石蜡切片2μm，65℃烤箱烤片15～20min。

1.4 实验方法：

1.4.1 BenchMark Special Stains全自动特殊染色机染色步骤如下：65℃烤片4min，75℃烤片4min；76℃加1000μL脱蜡液和液体封盖油膜脱蜡×4次，6min；37℃加清洗液清洗×2次；37℃加液体封盖油膜和2000μL PAS PERIOD.ACID染色4min；45℃加清洗液和液体封盖油膜清洗×2次；45℃加液体封盖油膜和2000μLPAS SCHIFFS染色，20min；45℃加清洗液和液体封盖油膜清洗×2次，9min；45℃加液体封盖油膜和2000μLPAS HEMATOXYLIN染色，8min；冲洗；手工脱水透明，仪器染色时长80min。

1.4.2 手工PAS染色方法，切片脱蜡至水，蒸馏水洗3次，入1%过碘酸液10min，蒸馏水洗3次，入Schiff试剂40～60min，热水返红5min，自来水洗，入苏木素染液3min,自来水洗，入1%盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗3min，染色时长100～120min，脱水透明封片。

2.结果

细胞核呈蓝色，肾小球系膜、基底膜以及肾小管呈紫红色。手工染色时在染色时间不延长的情况下标本着色鲜艳程度随着染色次数的增加而降低，尤其外院标本（儿童标本）明显。机器染色结果稳定（图1～4）。

图1，2本院标本同一组织视野（PAS×400）图1手工PAS染色结果，图2机染PAS染色结果，肾小球和肾小管基底膜结构清晰，中性粒细胞浸润较图1更明显。图1、图2分别为手工和机器试剂的第一批次染色。图3，4 均为外院标本同一组织视野（PAS×400）图3手工PAS染色结果，为手工染色试剂的第一批次染色。图4机器染色结果，为机器套装试剂的第一批次染色。

3.讨论

手工PAS染色存在的主要问题：（1）我科肾脏穿刺标本包括本院肾内科及外院标本。由于标本类型、前期处理等存在差异因素，手工染色时不同来源的标本染色时间不同，非本院肾内科标本均需要延长Schiff试剂染色时间。（2）Schiff液配制繁琐、失效较快、保存条件较严格[3]。（3）染液是重复使用，染色时间需要逐步延长。（4）很多实验室自行配制的苏木素没有纯化，试剂里面有很多杂质及苏木精淀，且苏木素在使用过程中与空气接触会继续氧化，产生氧化膜，需要定期过滤苏木素，避免染色效果差。

BenchMark Special Stains全自动特殊染色机具有更多优势：（1）全程标准化。染色机有20个可独立控温、运行的玻片位，切片后可直接独立进行烘烤、脱蜡和组织化学染色等工作。（2）操作简单，染色自动化。机器根据标签信息自动匹配完成染色全过程。（3）染色时间较手工染色时间短。染色机可针对不同来源的标本个性化设置不同的染色程序，通过改变温度等方式在相同时间里完成染色且着色鲜艳，对比度明显。（4）商品化试剂盒，放4℃冰箱保存。一套试剂可染75张切片，我们科室4～5次用完一盒试剂，如此可避免多次复温导致试剂失效。染色机采用单张滴染技术，每张玻片均为新鲜试剂，保证染色质量稳定。

全自动染色机还具有以下特点：（1）切片染色过程中滴加液体封盖油膜，该油膜是一种低密度轻脂油，而染液多为水溶性试剂密度大于油膜，染色时油膜能够包裹在反应液和染液的外表层同时利用液体的张力，起到保温的作用同时防止试剂挥发，维持整张玻片反应体系恒定。（2）工作量大，玻片数量多时可设置过夜程序，夜间也可染色从而提高工作效率。（3）仪器可自动识别试剂量是否足够。（4）染色机可进行管道冲洗，避免真菌污染和不同染色的交叉污染。（5）喷射式清洗，降低染色背景。（6）废液排入废液桶，集中处理，避免污染环境。但是，全自动染色机试剂成本较高。

综上，全自动特殊染色机在肾脏PAS染色中流程标准化其效率、质量、稳定性等方面确实优于手工操作，能够为临床诊断提供可靠依据。