不同提取方法对五味子中木脂素成分提取率的影响

王佳烨，王晓丽，王新婷，单莹莹，李 贺，王春梅，孙红霞，张成义，陈建光，孙靖辉

(北华大学药学院，吉林 吉林 132013)

五味子是木兰科植物五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)的成熟干燥果实，具有极高的药用价值和营养价值，是一种新型的既可药用也可食用的功能性保健食品［1］.现代药理学研究表明:中药五味子中的化学成分有木脂素、挥发油、多糖等，其中木脂素类成分是其主要化学成分，具有肝保护、抗病毒、抗糖尿病、抗炎等功能［2-3］.有关五味子木脂素的提取方法有很多，包括超声提取法、超临界CO2流体萃取法、大孔吸附树脂法、渗漉法、回流法、索氏提取法等，但不同提取方法之间所得到的五味子木脂素提取率略有差异［4-7］.现通过对超声提取法、超临界CO2流体萃取法和大孔吸附树脂法进行比较，探讨3种提取方法对五味子木脂素提取率的影响.

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

高效液相色谱仪(Waters，USA，型号e2695)配有UV检测器(型号2998PDA)和色谱管理系统(版本号Millennium32);旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司，型号R206B);超临界CO2流体萃取仪(沈阳索福尔超临界萃取设备有限公司，型号TC-SFE-36-10-320S);AS系列超声波清洗机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司，型号AS5150A).

1.2 材料和试剂

五味子(吉林省集安五味子种植基地，由北华大学药学院生药教研室李凤丽教授鉴定为木兰科植物五味子的成熟干燥果实);分析级甲醇(天津市永大化学试剂有限公司);95%的乙醇(天津市致远化学试剂有限公司);大孔吸附树脂(HPD100，上海紫一试剂厂);五味子木脂素类成分标准品(成都普菲德生物技术有限公司，五味子醇甲(批号:wkq182022702)、五味子酯甲(批号:wkq18052805)、五味子醇乙(批号:wkq18020804)、五味子乙素(批号:wkq18030811)、五味子丙素(批号:wkq18020607)、五味子甲素(批号:wkq18032609)、五味子酚(批号:151116))，以上标准品纯度均超过98%;HPLC级甲醇、乙腈和乙酸乙酯(TEDIA，USA);实验用水为娃哈哈纯净水.

2 方法与结果

2.1 五味子木脂素提取工艺

2.1.1 大孔吸附树脂法

将五味子粉碎，过40目筛，然后称取150 g五味子粉末，加入1 200 mL的95%乙醇回流1 h，连续提取两次，合并两次的滤液，进行抽滤旋蒸.加入蒸馏水使乙醇浓度达到70%，放置24 h后进行抽滤旋蒸，加蒸馏水将提取液定容至浓度为0.1 g/mL.用大孔吸附树脂灌柱，柱高与直径比为1∶6，加入提取液(若V柱=25 c m3，则V样=70 mL).当提取液快达到大孔树脂以下时加入蒸馏水除去杂质(若V柱=25 cm3，则V样=50 m L)，之后用95%的乙醇洗脱(若V柱=25 cm3，则V样=100 mL)，收集乙醇洗脱液进行旋蒸.最后将旋蒸液在水浴锅上加热至完全无醇味，冷冻干燥，最终得到五味子木脂素粉末5 g，提取率为3.33%.

2.1.2 超临界 CO2流体萃取法

参考文献［8-9］方法，将五味子粉碎，过40目筛，称取150 g五味子粉末，加入萃取釜中，打开水浴，通入CO2，设定温度为45℃，当萃取装置达到设定温度时，打开压缩泵调节压力为30 MPa，将CO2流量调整为15 L/h，进行循环萃取120 min，待萃取完毕，关闭压缩机、钢瓶，放空CO2，将收集的液体进行冷冻干燥，得到五味子木脂素粉末 44.7 g，提取率为 29.8%.

2.1.3 超声提取法

参考文献［10-11］方法，将五味子粉碎，过40目筛，精密称取150 g五味子粉末，置于具塞三角瓶中，加入90%乙醇3 000 mL，超声提取30 min，将所得液体进行抽滤旋蒸，将旋蒸液在水浴锅上加热直至完全无醇味，冷冻干燥，最终得到五味子木脂素粉末21.42 g，提取率为14.28%.

2.2 色谱条件

五味子木脂素的测定参考苑广信等［12］的HPLC方法，色谱柱:Venusil XBP C18(L)色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);岛津 GVP 保护柱(4.6 mm);流动相:甲醇(A)，水(B)，梯度条件见表 1;柱温:27 ℃;流速:0.8 mL/min;检测波长:230 nm;进样量:10 μL.

表1HPLC梯度条件Tab.1 HPLC gradient conditions

2.3 溶液的制备

2.3.1 标准溶液的制备

精密称取五味子醇甲、醇乙、酯甲、甲素和乙素各3 mg，五味子丙素和五味子酚各2 mg，用适量甲醇超声溶解后定容于10 mL容量瓶中，得对照品储备液，4℃储存备用，并作为混合标准品.

2.3.2 五味子木脂素样品溶液的制备

取3种提取方法所得到的提取物各50 mg，用适量甲醇溶解后定容于10 mL容量瓶中，得到浓度为5 mg/mL的样品储备液，4℃储存备用，并作为待测样品.

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

将混合标准品分别稀释至不同倍数，得到8个浓度梯度的标准品储备液，浓度0.006～0.300mg/mL.分别精密量取标准品储备液各1.0 mL，注入进样品中，取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱峰面积.以峰面积y为纵坐标，对照品质量浓度x(mg/mL)为横坐标，进行线性回归，得各组分的回归方程和相关系数，结果见图1和表2.结果显示:各组分在实验范围内线性关系良好［13-14］.

2.4.2 定量限(LOQ)和检出限(LOD)

精密量取混合对照品溶液1 mL，采用倍比稀释法制成系列质量浓度的溶液，进行色谱分析，记录色谱峰面积，以信噪比10∶1作为定量限，信噪比3∶1作为检出限.测得五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的定量限分别为 20，18，14，18.5，18，19.5，17 μg/mL;检出限分别为 7，4，3.5，4.5，5，6.5，5.5 μg/mL.

2.4.3 精密度实验

取0.1 mg/mL的混合对照品溶液，进行色谱分析，连续测定6次，每次进样10 μL，记录各色谱峰的相对峰面积，以峰面积计算RSD，RSD值为0.76%～1.89%，结果显示:本方法测定的7种木脂素含量的精密度良好.

2.4.4 稳定性考察

取 0.1 mg/mL 的混合对照品溶液，按 2.2 色谱条件，分别于 1，2，4，8，16，24 h 进样测定，记录各色谱峰的相对峰面积，以峰面积计算RSD，RSD值为0.84%～1.77%，结果显示:本方法在24 h内测定的7种木脂素含量的稳定性良好.

2.4.5 重复性考察

取五味子原药材，按2.1中的3种方法提取五味子木脂素，每种方法提取的五味子木脂素均平行制备5份浓度为5 mg/mL的供试品溶液，进行色谱分析，记录各色谱峰的相对峰面积，以峰面积计算RSD，大孔吸附树脂法提取得到的7种木脂素RSD值为0.79%～1.88%，超临界CO2流体萃取法提取得到的7种木脂素的RSD值为0.66%～1.72%，超声法提取得到的7种木脂素的RSD值为0.93%～1.91%，结果显示:本方法测定样品中7种木脂素含量的重复性良好.

2.4.6 回收率试验

采用加样回收法，精密称取已知7种木脂素含量的药材粉末9份，每份0.1 g，分别按高中低3个浓度精密加入7种木脂素对照品溶液，每一浓度平行加入3份，制备得样品溶液，进行色谱分析，计算回收率.计算可知，在高中低3个加标浓度下，7种木脂素的平均回收率为94.3%～103.7%，回收率RSD值为 0.8 6%～1.75%，结果显示:本方法测定的7种木脂素含量的回收率良好.

2.5 样品测定

分别取3种提取方法得到的木脂素待测样品溶液各1 mL，通过0.45 μm的有机膜注入进样瓶中，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，根据回归方程计算含量，求得样品中7种木脂素的含量，每种提取方法均平行实验3次.结果见图2和表3.

3 讨 论

就五味子木脂素的提取方法而言，传统溶剂提取耗时，溶剂需求量大，工艺复杂，流程长，重现性差，提取效率低，存在许多固有的缺陷，且常用的有机溶剂大多有毒，易造成环境污染，危害实验操作人员的健康［15］.现代科技的发展优化了传统的提取方法，使五味子木脂素的提取无论在实验操作安全还是提取率上都大大增强.超临界CO2萃取法临界温度低，提取原料中的有效成分能被很好保存，特别适合提取对热敏感、易氧化分解的成分.另外，超临界CO2萃取法提取能力强，产率高，现已广泛应用于食品、化学和生物工程等领域［15］，但相对其他两种提取方法而言，此方法所采用的机器成本较高.超声提取法具有提取时间短、提取温度低、适应性广、操作简单易行的特点，被广泛应用于中药的提取分离中［16］.大孔吸附树脂法具有吸附性能好、价格低廉、可再生利用、洗脱剂安全、操作简单等优点［17］.从提取率上看，用超临界CO2流体萃取法提取的五味子木脂素提取率最高，总量可达 18.94 mg/g，提取物的提取率为 29.8%，远高于另外两种方法得到的提取物含量.超声提取法所提取的五味子木脂素含量为17.96 mg/g，得到提取物的提取率为14.28%.大孔吸附树脂提取五味子木脂素含量较少，为10.90 mg/g，得到提取物的提取率为3.33%，分析原因可能由于大孔吸附树脂虽然能除去杂质，但是也损耗了相当一部分木脂素.通过对五味子木脂素提取方法的不断探索和优化，期望得到更高纯度的五味子木脂素.本研究比较了3种方法提取五味子木脂素的优缺点，为五味子木脂素提取方法的选择提供了实验依据.