铁皮石斛炭疽病病原鉴定及其生物学特性研究

胡永亮，白学慧，陈玉芹，李守岭，王应清

(云南省德宏热带农业科学研究所，云南 瑞丽 678600 )

铁皮石斛Dendrobiumofficinale为兰科石斛属多年生草本植物，是我国传统中药材中珍稀名贵品种之一。因其药用价值极高，自然繁殖率低，市场需求量大，以及前期过度采挖等因素，野生铁皮石斛已成为濒危物种。目前，人工规模化种植是提供铁皮石斛市场供给的主要途径。云南作为铁皮石斛的主要分布区和适生区，在瑞丽、芒市、盈江、龙陵、腾冲等21个县市均有人工种植。2015年笔者在瑞丽市调查铁皮石斛病害，发现一种铁皮石斛叶斑病。该病害给种植农户带来了严重的经济损失，也阻碍了当地石斛产业的发展。笔者采用传统形态学鉴定与rDNA-ITS测序鉴定相结合方法，主要对云南瑞丽市铁皮石斛种植区的石斛叶斑病病原进行鉴定，并初步观察研究该病原的生物学特性。

1 材料与方法

1.1 材料来源 铁皮石斛病株采集、病害调查和接种试验均在云南省瑞丽市勐卯镇铁皮石斛种植基地进行。

1.2 病原菌分离纯化 将铁皮石斛叶片病健交界处组织剪成约0.5 cm×0.5 cm的正方形小块，依次经75%乙醇和0.1%升汞消毒，再用无菌水洗涤3次后，置于PDA培养基中28 ℃避光培养120 h后，纯化菌落并进行单孢分离获得菌丝分离物。

1.3 分离物致病性测定

1.3.1 离体接种 使用针刺接种法，将纯化的菌丝分离物接种到健康的铁皮石斛叶片上，在28 ℃的人工培养箱内保湿培养；对照组为无菌水处理，每处理20叶片。定期观察石斛叶片发病情况，再对接种发病的石斛叶片进行病原菌分离。

1.3.2 田间接种 采用苗床喷雾接种，试验组设3个重复，1个对照，每个重复面积为2 m2，共140株；将病原分离物配制成孢子悬浮液(105个/mL)，喷洒在田间健康生长的铁皮石斛叶片上，保湿24 h以上。对照组为无菌水处理，处理10株。定期观察发病情况并再次分离病株病原。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 形态学鉴定 观察病原菌在PDA培养基上的菌落特征，采用Olympus CX-31显微镜对病原菌的分生孢子、附着胞形态和大小进行观察和测量，每个特征测量50个数据；采用易创YM130数字摄像机进行显微照片的拍摄。参照魏景超 等编写的《真菌鉴定手册》及陆家云编写的《植物病原真菌学》[1-2]鉴定病原菌。

1.4.2 分子生物学鉴定 提取rDNA采用CTAB法。随机从形态学特征相同的4份菌株中选择1株编号为SH-2的菌株，采用生工生物工程(上海)股份有限公司合成的真菌ITS5′-3和ITS4(5′-3′)通用引物进行PCR扩增[3-4]。

ITS1(5′-3′)：TCCGTAGGTGAACCTGCGC

ITS4(5′-3′)：TCCTCCGCTTATTGATATGC

反应体系50 μL包含：10×Ex Buffer 5 μL，dNTP (2.5 mM) 1 μL，Primer (10 μM) 各2 μL，Genomic DNA 100 ng，Ex Taq (5U/μL) 0.5 μL(Takara，RR001B)；ddH2O补至50 μL。

反应条件包含：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃复性30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测[5]。PCR扩增产物测序后与GenBank相关数据进行同源性分析，构建系统发育树(DNAMAN)。

1.5 病原菌生物学特性测定

1.5.1 温度对病原菌菌丝生长和产孢的影响 将直径为7 mm的菌块接种到PDA平板上，置于恒温培养箱中(温度设置分别为5，10，15，20，25，28，30，35 ℃ 等8个梯度处理)，培养至第5天时采用十字交叉法测量菌落直径，第10天时在每个PDA平板中加入20 mL灭菌水后刮下分生孢子，制成孢子悬浮液，用血球计数板法测定产孢量。每个处理重复4次。

1.5.2 pH值对病原菌菌丝生长和产饱的影响 将直径为7 mm的菌块分别接种到不同pH值(pH=3，4，5，6，7，8，9，10，11)的PDA平板上(用1 M的盐酸或氢氧化钠溶液调节)，28 ℃培养至第5天时采用十字交叉法测量菌落直径，第10天时血球计数板法测定产孢量。每个处理重复4次。

1.5.3 不同碳、氮源对病原菌菌丝生长和产孢的影响 采用真菌生理培养基(氮源1 g、碳源5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL)。以硝酸钾为氮源，将直径7 mm的菌丝分别接种在分别含葡萄糖、淀粉、蔗糖、果糖、甘露醇、麦芽糖和甘油等作为不同碳源的培养基中，分别测定8种碳源时对微生物生长的影响，以无碳源培养基为对照。以葡萄糖为碳源，将直径7 mm的菌丝分别接种到含酵母膏、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、尿素、硝酸钾和硝酸钠等不同氮源的培养基中，分别测定7种氮源对微生物生长的影响，以无氮源培养基为对照。培养温度均为28 ℃，到第5天时测量菌落直径并观察菌落生长状况。每个处理重复4次。

1.6 数据分析 采用DPS6.55软件进行数据分析，Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 病害症状 该病主要危害石斛叶片。叶片感病初期出现深褐色圆形小点，后逐渐变大形成深褐色近圆形或不规则形凹陷病斑，病斑边界清晰，后期病斑上散生许多黑色小点。湿度增大时，病斑上出现橙红色黏性物。病斑密集的叶片褪绿，之后脱落(图1A)。该病全年发生，以5—7月甚为流行。

2.2 病原菌的分离和致病性测定 对7个铁皮石斛叶片病害样进行病原分离，分离纯化后得到4株形态学特征一致的菌株。经针刺法接种到离体叶片上后，发病率可达100%。接种第7天叶片开始表现症状，在接种部位形成黑色近圆形病斑。田间接种10 d后，3个重复的发病株依次为114株、121株、119株；发病率均在80%以上。其症状与自然发病症状表现一致(图1B)，且分离接种致病植株能再次分离出与接种菌株形态一致的病原菌。对照组无表现症状。

图1 铁皮石斛炭疽病田间发病症状

2.3 病原菌的形态学鉴定 在PDA平板上培养5 d后，该病原菌菌落呈圆形，菌丝排列整齐，毛绒状(图2A)，菌丝初为白色，后渐变为灰白色或深灰色。培养7 d后，靠近菌落中央产生轮状排列的分生孢子盘，并产生红色分生孢子团(图2B)。附着孢卵圆形深褐色，(5.6～11.8)μm×(4.1～6.7)μm(图2C)。分生孢子为圆柱近椭圆形，无色，单胞，两端钝圆，(11.2～15.7)μm×(4.1～6.1)μm(图2D)。鉴定该病原菌为胶孢炭疽菌Colletotrichumgloesporioides(Penz.)。

图2 病原菌菌落/附着胞和分生孢子的形态特征

2.4 分子生物学鉴定 病原菌的rDNA通过PCR扩增后，对扩增产物进行测序，获得551bp的DNA序列(GenBank登入号为KP229358.1)。在NCBI数据库中进行Blast比对。结果显示，菌株与登入号为JN687987.1(Colletotrichumgloeosporioides)的菌株相似性最高，达99%。进一步构建炭疽菌不同种的系统发育树的结果显示SH-2菌株与引起苦瓜炭疽病的C.gloeosporioides菌株(登入号为JN687987.1)遗传距离最近，位于系统发育树的同一分支(图3)。

ITS序列分析证实菌株SH-2为Colletotrichumgloeosporioides，结合形态学鉴定结果认为引起铁皮石斛炭疽病的病原菌为半知菌亚门腔孢纲黑盘孢目炭疽菌属的胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

注：分支点上的数字代表基于1000次重复的Bootstrap自举值图3 炭疽菌不同种的系统发育树

2.5 病原菌的生物学特性

2.5.1 温度对菌丝生长和产孢量的影响 铁皮石斛炭疽病病原菌菌丝在不同温度条件下培养5 d，菌丝生长量呈现先升后降的趋势(图4)。在5 ℃时，病原菌菌丝直径仍为接种时大小；在10 ℃时，病原菌菌丝开始向外蔓延，扩展直径可达10 mm；在15～28 ℃时，菌丝直径随温度升高逐渐变大；至28 ℃时菌丝生长量最大，扩展直径可达52 mm；在28～35 ℃，菌丝生长随温度升高而急剧下降，35 ℃下菌丝生长已非常缓慢，菌丝未见明显扩展。说明该致病菌在低于5 ℃或高于35 ℃时，菌丝生长均受温度条件限制；菌丝生长的温度范围为10～35 ℃，最适生长温度范围为15～30 ℃。该病原菌产孢温度范围为15～35 ℃，其中最适产孢温度为25～30 ℃。在15～30 ℃时，其产孢量随温度升高而增加，到达其最适产孢温度30 ℃时产孢量可达26×106个。从30 ℃上升到35 ℃时，产孢数量迅速下降，温度对其产孢能力破坏明显(图4)。

注：数据为平均数±标准差图4 不同温度对铁皮石斛炭疽菌生长和产孢的影响

2.5.2 pH值对菌丝生长和产孢量的影响 铁皮石斛炭疽病病原菌在pH值为3～11的PDA培养基上均能生长和产孢，但生长状态不尽相同，酸性条件更适宜其产孢，尤其是pH值为3～4时其产孢量最大；而菌丝最适生长pH值为5～6(图5)。

图5 不同pH培养基对铁皮石斛炭疽菌丝生长和产孢量的影响

2.5.3 不同碳源对菌丝生长的影响 胶孢炭疽菌对各种碳源均有较好的利用能力，菌丝生长良好，菌落直径显著高于对照(P<0.05)。该结果说明此菌对碳源要求不严格，能利用多种碳源，但利用能力有差异，利用能力由高到低依次为麦芽糖，果糖，葡萄糖，蔗糖，淀粉，甘露醇，乳糖，甘油，琼脂对照(表1)。

表1 不同碳源对铁皮石斛炭疽菌菌丝生长的影响

注：邓肯氏新复极差检验，表中数据为平均值±标准误。同一列数据后标有不同大写字母者表示组间差异极显著(P<0.01),标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P>0.05)。

2.5.4 不同碳源培养基上菌落特征 胶孢炭疽菌在葡萄糖、蔗糖、果糖培养基上菌落灰白色，絮状、菌丝生长茂盛，葡萄糖和蔗糖培养基中絮状菌落边缘比较整齐；果糖培养基中菌落边缘呈折扇状。在麦芽糖、淀粉培养基中的絮状菌落菌丝茂盛，边缘整齐，呈现灰青色。在乳糖培养基上菌落灰青色，毡状，质密，边缘整齐。在甘油培养基上菌落青绿色，毡状，质密，边缘整齐。在甘露醇培养基上菌落乳白色，毡状，边缘整齐。所有碳源培养基上均无明显轮纹产生。在对照培养基上菌落稀疏，白色，生长较差(图6)。

图6 不同碳源培养基上铁皮石斛炭疽病原菌菌落特征

2.5.5 不同氮源对菌丝生长的影响 硫酸铵、氯化铵作为氮源培养基明显不利于胶孢炭疽菌菌丝生长(P<0.05)，其他供试氮源均对该菌菌丝生长有显著促进作用(P<0.05)。说明该菌可以利用多种氮源，但对不同氮源利用能力存在显著差异，由高到低依次为蛋白胨，酵母膏，硝酸钾，尿素，硝酸钠，琼脂对照，硫酸铵，氯化铵。(表2)

2.5.6 不同氮源培养基上的菌落特征 胶孢炭疽菌在对照琼脂培养基上菌落灰黑色，菌丝质密，生长不旺盛；在硝酸钾培养基上菌落灰白色，絮状、菌丝生长茂盛，边缘整齐；在蛋白胨和酵母膏培养基上菌落灰白色，絮状，菌丝生长旺盛，边缘整齐；尿素培养基上菌落白色，絮状、菌丝生长茂盛，边缘整齐；硝酸钠培养基上菌落白色，絮状、菌丝生长茂盛，边缘整齐；在硫酸铵、氯化铵培养基上菌落白色，质密，边缘略显褶皱。所有氮源培养基上均无明显轮纹产生(图7)。

表2 不同氮源对铁皮石斛炭疽菌菌丝生长的影响

注：邓肯氏新复极差检验，表中数据为平均值±标准误。同一列数据后标有不同大写字母者表示组间差异极显著(P<0.01),标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P>0.05)。

图7 氮源培养基上石斛炭疽病菌特征

3 结论与讨论

对于石斛炭疽病病原的研究，国内外报道较少，张翊 等[6]对采自金钗石斛的病原进行了鉴定，认为病原为胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。胶孢炭疽菌是引起多种经济作物炭疽病的病原菌，在我国热带、亚热带地区发生的柱花草炭疽病、杧果炭疽病、橡胶炭疽病等都是由真菌引起的[5-13]。铁皮石斛炭疽病，在国内只见王艳对铁皮石斛与炭疽菌的互作机制作过研究[14]，其他报道较少。能准确鉴定病原炭疽病菌(Colletotrichum) 对于植物炭疽病的防控相当重要，传统的病原鉴定方法采用形态学鉴定，但其形态特性因实验方法和条件不同而受到影响，鉴定结果常有偏差，现代分子生物学基于rDNA-ITS测序为病原菌的准确鉴定提供了稳定而可靠的方法，本研究采用传统形态学鉴定与rDNA-ITS 测序鉴定方法相结合，证实铁皮石斛炭疽病的病原菌为半知菌亚门腔孢纲黑盘孢目炭疽菌属的胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

胶孢炭疽菌菌丝的生长温度范围为10～35 ℃，最适生长温度范围为15～30 ℃；15～28 ℃时，菌丝直径随温度升高逐渐变大，至28 ℃时菌丝生长量最大；28～35 ℃时，菌丝生长随温度升高而急剧下降，35 ℃下菌丝生长已非常缓慢。该菌落生长的最高温度与黄炳金 等[15]对银杏炭疽病菌及雷百战 等[16]对新疆葡萄炭疽病菌的研究结果基本一致。铁皮石斛炭疽菌在pH值为3～11的PDA培养基上均能生长和产孢，但菌丝最适生长pH值为5～6，酸性条件更适宜其产孢，pH值为3～4时产孢量最大，此结果与杨叶[17]对香蕉果实炭疽菌的研究是一致的。

胶孢炭疽菌对各种碳源均有较好的利用能力，对碳源要求不严格，在供试的几种碳源中菌丝生长良好，但以麦芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖最利于产生菌丝。在不同氮源条件下，蛋白胨是最利于菌丝生长及产生分生孢子的氮源；硫酸铵、氯化铵作为氮源的培养基明显不利于石斛炭疽菌菌丝生长。

从胶孢炭疽菌的生物学特性室内测定可预知，田间温度变化与石斛炭疽病流行有密不可分的关系，高温高湿的气候条件有利于该病流行。因此，高温高湿季节应加强该病的防控工作。通过对石斛炭疽病病原鉴定及其病原的生物学特性研究，可为今后研究该病的内部发病机制如蛋白组学、基因组学等方面提供参考。