斑点追踪成像评价脓毒症大鼠早期心肌损伤及柚皮苷预处理效果

孙立娟，任卫东，乔 伟，肖杨杰，崔 莉

(1.中国医科大学附属盛京医院超声科，辽宁 沈阳 110004；2.秦皇岛市第一医院超声科，河北 秦皇岛 066000)

脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)是革兰阴性菌外膜的主要成分，可引起人或动物脓毒症[1]。早期器官功能障碍是脓毒症患者死亡的主要原因，心脏是易受累器官之一。柚皮苷(naringin， Nar)是天然黄酮类化合物，具有多种生物学活性，如抗感染、抗凋亡、神经保护、抗动脉粥样硬化等[2-3]。斑点追踪成像(speckle tracking imaging， STI)技术应变及应变率等参数对评价心肌早期损伤具有较高敏感性[4]，但用于脓毒症心肌损伤的研究较少。本研究探讨STI技术评价LPS诱导脓毒症大鼠早期心肌损伤及Nar预处理对逆转心肌损伤效果的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠36只，8周龄，体质量285～305 g，购于北京华阜康生物技术股份有限公司[动物许可证号：SYXK(辽)2017-0004]。本研究经中国医科大学附属盛京医院动物伦理委员会批准。

1.2 动物模型建立及分组 将36只SD大鼠随机分为LPS+Nar50组(n=9)、LPS+Nar100组(n=9)、LPS组(n=10)及对照组(n=8)。对LPS+Nar50组、LPS+Nar100组大鼠分别灌胃给予50、100 mg/kg体质量Nar混悬液(Sigma)，对照组、LPS组灌胃给予等量生理盐水；4组大鼠均每日灌胃1次，连续7天，最后一次灌胃后1 h，LPS+Nar50组、LPS+Nar100组及LPS组均腹腔注射5 mg/kg体质量LPS(Sigma)，对照组给予等量生理盐水。

1.3 仪器与方法 采用GE Vivid E9超声诊断仪，12S探头，频率9～12 MHz，帧频120～200帧/秒，于LPS/生理盐水注射6 h后对4组大鼠行戊巴比妥钠(30 mg/kg体质量)麻醉，将大鼠左侧卧位保定于检查床，连接同步肢体导联心电图，获取超声参数。采用改良Simpson法检测左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)，组织多普勒显像检测室间隔侧二尖瓣环运动频谱，计算Tei指数，均取3个心动周期的平均值作为结果。

连续采集5个心动周期左心室乳头肌水平短轴切面图像，采用EchoPAC工作站进行分析，手动勾勒ROI，调节ROI直径至各节段均显示满意，系统自动将心肌分为心内膜下心肌、中间心肌层及心外膜下心肌区域，获得前间隔、前壁、侧壁、后壁、下壁及后间隔各节段圆周应变(circumferential strain, SC)峰值，左心室心内膜、中间层及心外膜下心肌整体SC(global circumferential strain, GSC)峰值(分别记为GSCendo、GSCmid、GSCepi)、收缩期圆周应变率(circumferential strain rate, SrC)峰值(SrC S)、舒张早期SrC峰值(SrC E)、舒张晚期SrC峰值(SrC A)，结果取5个心动周期的平均值。见图1。

1.4 心肌酶检测 于超声检查后麻醉状态下以毛细管行眼眶采血，采用全自动生化分析仪检测血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平。

1.5 心肌组织病理学检查 眼眶取血后处死所有大鼠，取左心室中间段心肌以10%多聚甲醛固定，常规切片后HE染色观察病理改变。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计分析软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，4组大鼠左心室各节段SC峰值、GSC峰值、SrC峰值、LVEF、Tei指数及CK、LDH比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

造模6 h后，对照组大鼠无明显异常，其余3组大鼠均见食欲下降、行动迟缓。LPS组大鼠呼吸增快，精神萎靡，嗜睡，竖毛，排稀水样便等；LPS+Nar50组、LPS+Nar100组大鼠一般状况较LPS组轻，LPS+Nar50组大鼠精神稍萎靡，竖毛，排少量稀水样便，LPS+Nar100组大鼠精神尚好，排少量稀水样便。LPS组2只、LPS+Nar50组及LPS+Nar100组各1只因声像图质量差被剔除。

2.1 左心室各节段SC峰值 4组大鼠左心室各节段SC峰值比较总体差异均有统计学意义(P均<0.001)。LPS组左心室各节段SC峰值均低于对照组和LPS+Nar100组；LPS+Nar50组前间隔、前壁、下壁及后间隔SC峰值均高于LPS组，均低于LPS+Nar100组；LPS+Nar50组侧壁SC峰值低于LPS+Nar100组；组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

2.2 左心室整体SC峰值及SrC峰值 4组左心室GSCendo、GSCmid、SrC S、SrC E及SrC A比较总体差异均有统计学意义(P均<0.01)。LPS组GSCendo、GSCmid、SrC S、SrC E及SrC A均低于其余3组(P均<0.05)；LPS+Nar50组GSCmid、SrC S、SrC E及SrC A均低于LPS+Nar100组(P均<0.05)。见表2、图1。

2.3 LVEF、Tei指数及CK、LDH 4组LVEF、Tei指数、CK及LDH比较总体差异均有统计学意义(P均<0.001)。LPS组Tei指数、CK及LDH均高于其余3组，LVEF均低于其余3组(P均<0.05)；LPS+Nar50组Tei指数、CK及LDH均高于LPS+Nar100组，LVEF低于LPS+Nar100组(P均<0.05)。见表3。

表1 4组大鼠左心室各节段SC峰值比较(%，±s，n=8)

表1 4组大鼠左心室各节段SC峰值比较(%，±s，n=8)

组别SC峰值前间隔前壁侧壁后壁下壁后间隔LPS组-6.76±4.01*-6.94±2.56*-5.87±2.10*-8.07±2.59*-4.08±3.17*-5.44±2.22*LPS+Nar50组-10.96±1.85#-10.61±2.00#-8.09±2.62-11.81±2.10-8.67±3.52#-8.84±2.62#LPS+Nar100组-17.01±3.58#△-15.49±2.74#△-11.23±2.69#△-13.21±2.47#-13.13±2.78#△-14.26±2.73#△对照组-23.99±2.60-17.01±3.58-18.00±3.55-16.55±3.87-20.61±4.32-21.77±3.99F值46.01515.25228.67812.23113.16246.092P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：*：与对照组比较，P<0.05；#：与LPS组比较，P<0.05；△：与LPS+Nar50组比较，P<0.05

表2 4组大鼠左心室各层SC及SrC比较(±s，n=8)

表2 4组大鼠左心室各层SC及SrC比较(±s，n=8)

组别GSCendo(%)GSCmid(%)GSCepi(%)SrC S(s-1)SrC E(s-1)SrC A(s-1)LPS组-13.96±3.43*-7.16±3.28*-5.15±2.37-5.59±1.01*5.07±1.28*3.07±1.66*LPS+Nar50组-21.71±3.58#-9.84±2.26#-6.31±1.87-8.00±1.68#7.82±0.72#6.05±2.07#LPS+Nar100组-23.08±2.33#-12.83±1.66#△-5.95±1.87-10.27±1.31#△9.16±0.92#△8.04±1.11#△对照组-24.04±3.06-14.03±2.64-6.78±2.07-10.85±2.2911.74±1.958.77±1.43F值5.06711.9120.89416.99736.17620.148P值0.006<0.0010.457<0.001<0.001<0.001

注：*：与对照组比较，P<0.05；#：与LPS组比较，P<0.05；△：与LPS+Nar50组比较，P<0.05

表3 大鼠LVEF、Tei指数及CK、LDH比较(±s，n=8)

表3 大鼠LVEF、Tei指数及CK、LDH比较(±s，n=8)

组别LVEF(%)Tei指数CK(U/L)LDH(U/L)LPS组55.00±3.16*0.71±0.02*3 346.50±297.32*2 856.25±380.00*LPS+Nar50组65.63±2.50#0.64±0.03#2 015.00±224.04#2 095.50±339.65#LPS+Nar100组75.38±2.50#△0.59±0.02#△1 209.50±239.90#△1 343.13±257.18#△对照组81.75±5.340.50±0.03394.25±173.21699.00±152.10F值85.65697.658223.98979.863P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：*：与对照组比较，P<0.05；#：与LPS组比较，P<0.05；△：与LPS+Nar50组比较，P<0.05

图1 大鼠左心室乳头肌水平整体SC曲线 A.对照组； B.LPS组； C.LPS+Nar50组； D.LPS+Nar100组

2.4 心肌组织病理检查 对照组心肌纤维肌丝束排列整齐，细胞结构正常，横纹清晰；LPS组心肌部分细胞核固缩，心肌纤维部分断裂，充血明显，炎性细胞增多；LPS+Nar50组、LPS+Nar100组上述病理改变较LPS组明显减轻，与LPS+Nar50组相比，LPS+Nar100组心肌纤维肌丝束排列尚整齐，充血不明显，炎性细胞明显减少。见图2。

3 讨论

脓毒症早期即可发生心肌损伤，LPS可诱发脓毒症心肌损伤，主要机制为LPS刺激免疫细胞，激活免疫应答，导致多种促炎因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)、白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)等生成增加[5]，并降低心肌收缩力，造成心肌损伤。本研究给予大鼠腹腔注射LPS后，大鼠呼吸增快、精神萎靡、嗜睡、竖毛、排稀水样便，LVEF减低，Tei指数升高，心肌酶CK、LDH表达上调，心肌组织部分细胞核固缩，心肌纤维部分断裂，充血明显，炎性细胞增多，表明大鼠心肌细胞损伤，提示造模成功。

LPS组左心室各节段SC峰值及各时相SrC峰值均较对照组减低，曲线低平，而Nar预处理组SC及SrC峰值均升高，表明LPS损伤大鼠心肌收缩期、舒张早期及晚期圆周运动，Nar能够缓解上述心肌损伤。圆周运动反映心脏短轴方向的环形运动，于收缩期缩短、舒张期延长，是左心室心肌重要的运动形式之一。Narayan等[6]报道，SC联合心室-动脉耦联可用于预测化疗药物导致的心肌功能不全。左心室心肌分为心内膜、中间层及心外膜3层，STI技术能够评价整体心肌的运动，亦能评价分层心肌应变，且无角度依赖性。相对于整体应变，分层应变更符合左心室心肌的3层肌带解剖结构，结果更客观。本研究4组大鼠GSC由内到外均逐渐减低，由于3层心肌存在跨壁速度梯度，心内膜下心肌为向心运动，且处于冠状动脉供血的最远端，缺乏侧支循环，受收缩期心肌压迫明显，因此缺血最显著，而心外膜下心肌在心肌收缩时相对静止[7-8]；给予LPS后大鼠左心室GSCendo及GSCmid均较对照组减低，提示大鼠心肌明显受损，其中心内膜下心肌及中间层心肌受损为著。

图2 大鼠心肌组织病理图(HE，×400，箭示炎性细胞浸润) A.对照组； B.LPS组； C.LPS+Nar50组； D.LPS+Nar100组

Nar属于天然黄酮类化合物，具有多种生物学活性和药理特性。摄入富含黄酮类化合物的食物可减少心血管疾病发生率及死亡率[9]。Nar可抑制阿霉素致大鼠心肌损伤，增强线粒体复合物(Ⅰ～Ⅳ)活性、改善氧化应激可能是其作用机制[10]。You等[11]发现Nar促进B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)表达，抑制炎症通路核转录因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)磷酸化及细胞凋亡因子半胱天冬酶3(caspase-3)、Bcl2-相关X蛋白(Bcl2-associated X protein, Bax)表达，进而对高糖引起的心肌损伤发挥保护作用。本研究中，与LPS组比较，LPS+Nar50组、LPS+Nar100组大鼠一般状况好转，CK、LDH水平降低，LVEF升高，Tei指数降低，左心室各节段SC峰值及GSCendo、GSCmid均升高，心肌组织病理改变减轻，提示Nar预处理可抑制LPS诱导的心肌损伤。

本研究的局限性：所用12S婴幼儿探头非小动物专用探头，但大鼠胸壁薄，分辨率尚好；大鼠心脏相对于婴幼儿小，且心率更快，在左心室短轴各切面分界不甚明显，故选用乳头肌水平切面SC作为左心室短轴GSC，大鼠四腔心切面心尖部分显示较差而未纳入长轴纵向应变；关于Nar通过何种分子机制发挥心肌保护作用尚需进一步研究。

总之，STI技术可用于评价LPS诱导脓毒症大鼠早期心肌损伤及Nar预处理减轻心肌损伤的效果。