应用分子标记辅助选育洋葱不育系及其杂交应用

杨海峰，惠林冲，陈 微，李威亚，何林玉，郇国磊，王江英，徐卫平，李景芳，缪美华，陈振泰，潘美红

(1.连云港市农业科学院，江苏 连云港 222000；2.江苏省云台农场有限公司，江苏 连云港 222000)

洋葱(AlliumcepaL.)是世界上重要的蔬菜品种之一，日本、韩国、美国等国家早已开展洋葱杂交种选育。目前国内主要是常规种选育，杂交种选育也在探索中。洋葱生育周期长，跨越3个年度，常规育种选育周期长；在杂交育种中主要利用洋葱细胞质雄性不育系(CMS，cytoplasmic male sterility)进行杂交配组，选育对应的保持系，扩繁所需时间至少10年以上。随着分子生物技术的发展与应用，国内外高校、科研院所等机构开始对洋葱细胞质雄性不育进行分子标记研究，首次在洋葱品种‘Jaune paille des Vertus’[1]和‘Italian Red’[2]中分别发现了CMS-T和CMS-S两种细胞质雄性不育类型。利用DNA分子标记已开发出能够通过PCR鉴定出洋葱可育与不育株，以及不育株不育类型，如利用cob[3]标记能够区分CMS-S型，orfA501[4]标记在洋葱不育株中扩增出473 bp条带，与cob标记相结合可以区分洋葱可育株N、CMS-S和CMS-T；利用Cp-cytotype[5]、cob-type2和atp6[6]标记都能鉴定CMS-S型，但不能区分正常可育株N和CMS-T；利用orf725[7]和Cpp1[8]能够将洋葱3种类型完全区分开。不育系标记的开发能够在配组的F1苗期鉴定出不育株，从而确定父本是否是对应的保持株，加快不育系的选育进程。

同时，与洋葱保持系育性相关的分子标记也已被开发出来，jnurf13[9]、AcSKP1[10]、DNF-566、RNS-357[11]、OPT和PsaO[12]均为与育性Ms位点相关的分子标记，从中筛选出jnurf13适合作为保持系鉴定的分子标记[13]。可以在田间大量筛选出优秀的保持株，混合杂交选育稳定的保持系，扩繁对应的不育系，缩短保持系的选育周期，为杂交制种提供亲本材料。本课题围绕洋葱不育系的选育，选育出101A、A1、A3、D-9和T 5份不育系材料，通过分子标记验证或分子标记辅助选育，为杂交品种的选育提供丰富多样的母本材料。利用101A(5001)为母本育成具有高产、综合性状优良的自主杂交品种连葱096[14]，配制大量杂交组合，筛选优良父母本材料。洋葱可食用器官为地下鳞茎，与水稻、小麦、玉米、大豆等其他植物可食用器官不同，生产中种植户不需要采收种子，对洋葱育种提出新的思路：洋葱全不育型杂交种的选育，2014年开始利用优良不育系与父本(保持系)进行杂交，筛选组合，为洋葱育种奠定材料基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源及特征

试验材料全部来自于连云港市农业科学院蔬菜研究室中日照洋葱，101A和101B、D-9和d-9、A1和a1、A3和a3、T和t分别为相配套的不育系和保持系，5套不育系材料的引种名称、来源、单位和时间见表1，分别编号为1～5号；2018年新引进14份杂交种，2016年自主选育2份全不育型杂交种A1×3C和T×912，共计16份材料，于2018年10月全部利用orf725分子标记在苗期进行育性验证，材料特点见表2。以黄皮洋葱的不育系A1和D-9为母本，配制64份杂交组合，分别编号为22～85号。

表1 洋葱不育材料的来源及特点

表2 2018年新引进中日照洋葱杂交种材料

1.2 试验方法

试验材料在连云港市农业科学院蔬菜试验基地种植，取洋葱苗期叶片，液氮保存，用DNA试剂盒(型号：DP350-03)提取洋葱基因组DNA，引物由苏州金唯智生物有限公司合成(表3)，PCR扩增试剂购置于TAKARA公司，反应体系为25 μL，包括：2 μL DNA(0.1 μg)，2.5 μL 10×PCR buffer，1.25 μL(10 μmol/L)正向引物，1.25 μL(10 μmol/L)反向引物，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.25 μL TaqM和15.8 mL ddH2O，cob(s)、cob(n)和orf725的PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min[13]。jnurf13的PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，65 ℃(每循环递减0.8 ℃)退火30 s，72 ℃延伸1 min，10个循环；95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min[9]。cob(s)、cob(n)、orf725的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，jnurf13的PCR产物采用9%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电压100 V，电泳3 h，硝酸银染色，采用佳能EOS6D相机在胶片灯上拍照记录。

洋葱杂交种配制于2016年10月至2018年6月进行，以A1和D-9两份不育系材料为母本进行杂交组合配制，种球行间距15 cm×35 cm，父母本按照1∶3的行数进行配比，每个制种小区6 m2，采用防虫网进行全封闭隔离，在开花期采用苍蝇辅助授粉。2017年9月将收集的洋葱杂交种播种育苗，洋葱苗定植行间距15 cm×15 cm，每个小区32 m2，重复3次。试验小区随机排列，同大田正常管理。

1.3 数据处理

取每小区对角线上3点，每点随机选取20株，于2018年3月29日开始调查统计洋葱田间生长情况，记录膨大期、倒秧期、植株长势、叶片姿势、叶片数、假茎粗；2018年5月23日采收后，调查洋葱球颜色、球形、球形指数、单球重；采收后分别测3小区产量。

表3 洋葱分子标记引物

2 结果与分析

2.1 洋葱不育系分子标记辅助选育

2.1.1 101A不育系的选育及特征 101A不育系主要通过田间配组选育，2003年形成稳定的不育系，通过cob(s)和cob(n)分子标记进行育性验证，1号和2号为可育株101B，3号和4号为不育株101A，2号和4号为cob(n)引物PCR扩增，cob(n)标记结果显示在180 bp均有条带，说明101B(1号、2号)和101A(3号、4号)是可育或T型细胞质不育；1号和3号为cob(s)引物PCR扩增，cob(s)标记结果显示只在3号中有414 bp大小条带，说明101A(3号)为CMS-S型不育(图1)。洋葱雄性不育系101A株高85 cm左右，功能叶10～13片，鳞茎的假茎粗1.2 cm左右，鳞茎表皮棕黄色，圆球形，单球重200～300 g，晚熟(图2)。

2.1.2 不育系A1和D-9的选育及特征 2003年从日本引种秀玉丸玉葱，2005年从韩国引进DSD-001，经多代自交筛选，2009年5月中下旬在2个品种留种田中分别发现15株(52个花序)和20株(70个花序)不育株，当年分别在同一品种中用可育株与不育株花序随机配组，可育株部分套袋自交；2009年8月下旬分别对可育株和自交父本进行塑料大棚小株留种法播种；2010年3月通过orf725分子标记对F1苗期进行不育株鉴定，部分检测结果如图2，1、2、3号为秀玉丸玉葱(d-9)可育单株自交，4、5、6号为DSD-001(a1)可育单株自交，7、8、9号为1、2、3号父本与秀玉丸玉葱不育株杂交F1(D-9)，10、11、12号为4、5、6号父本与DSD-001不育株杂交F1(A1)；结果显示orf725能够在可育株(1～6和12号)中扩增出一条833 bp；在7～11号中扩增出833 bp和628 bp两条带，为CMS-T型不育株(图3)，所以1～3号为d-9保持株，7～9号为D-9不育株，将分子标记鉴定出的D-9和d-9分别混合扩繁；4和5号为a1，10和11号为A1，a1和A1分别混合扩繁，6号和12号则淘汰。2010年9月中旬将收获的种子播种，2011年5月底收获种球及9月定植，2012年7月收获种子，同年9月播种，2014年7月收获种子，经3代扩繁于2014年形成稳定的不育系A1和D-9。

不育系A1的基本特性：早熟，生长势旺，植株直立，7～8片管状叶，株高55～65 cm。生育期为230 d左右。鳞茎圆球形，假茎较细，球型指数0.85左右，平均单球重190 g，球形整齐。平均产量为64500 kg/hm2。商品性好，外皮黄色，有光泽，有甜味，在自然存储中腐烂率和发芽率低(图4A)。

不育系D-9基本特性：早熟，生长势旺，植株直立，7～8片管状叶，叶片蜡粉多，株高60～70 cm。生育期为225 d左右。鳞茎圆球形，假茎较细，葱球顶部偏平，球型指数0.75左右，平均单球重180 g，球形整齐。平均 产量为67500 kg/hm2。商品性好，鳞片包裹紧密，外皮黄色，有光泽，有甜味，抗病能力强(图4B)。

图2 洋葱101A的田间表现

图4 A1和D-9不育系田间采收

2.1.3 不育系A3和T的选育及特征 2005年从日本引进早春黄3号，2010年选育出红皮406，经过多代群体选择，形成稳定的优良资源，2015年5月洋葱开花初期在留种田中发现早春黄3号和红皮406分别有8株和13株不育株，去除已开的花朵，套袋防止其他花粉污染，同时分别在同一品种中收集可育株150株，利用jnurf13分子标记对可育株DNA进行筛选，3 d内完成保持系的筛选。jnurf13分子标记可以用于区分MsMs、Msms、msms3种类型，能够在含有Ms位点中扩增出241 bp，在含有ms位点中扩增出229 bp，在含有Msms中能扩增出两条带，在早春黄3号150株中有19株含有一条229 bp的条带，为保持株(a3)(部分电泳图，图5A)，与8株不育株集中隔离授粉；同样在406中筛选出18株保持株(t)(部分电泳图，图5B)，与13株不育株集中隔离授粉。2015年8月上旬分别对两份材料F1播种(塑料大棚小株留种法)，11月通过orf725分子标记对F1苗期随机取30份样进行不育株鉴定，检测结果100%不育。2016年7月收获种子，8月上旬采用大棚小株留种方法播种，父母本按1∶3种植，2017年7月上旬收获种子，于2017年形成稳定的不育系A3(早春黄3号)和T(406)。

2017年9月初播种，2018年5月收获洋葱种球(图6)，不育系A3的基本特性：早熟，黄皮，生长势旺，植株直立，管状叶细长，株高55～65 cm。生育期为235 d左右。鳞茎长圆球形，假茎较细，球型指数0.90左右，平均单球重210 g，球形整齐。平均产量为67500 kg/m2。商品性好，外皮黄色，有光泽，辛辣味浓(图6A)。不育系T的基本特性：中熟，紫皮，扁球形，生长势旺，植株直立，管状叶细长，株高70～80 cm。生育期为250 d左右。假茎较细，球型指数0.70左右，平均单球重240 g，球形整齐。平均产量为75000 kg/m2。商品性好，皮色紫，有光泽，辛辣味浓(图6B)。

图6 A3和T不育系田间采收

2.2 洋葱杂交种组合筛选

以A1和D-9两份不育系材料为母本进行63份杂交组合配制，于2016年10月开始将配组种球进行定植，2017年4月隔离网隔离，苍蝇辅助授粉，7月收获F1种子，9月播种育苗，2018年5月进行采收。在表4中有16个杂交组合 平均产量达75000 kg/hm2以上，叶片直立向上，长势旺，圆球形，适合高密度栽培，有利于提高产量。在黄皮洋葱中40号(D-9×745)、39号(D-9×562)和23号(A1×3C)产量相对较高，分别达到92545.5、91294.5、83166.0 kg，23号的产量虽然在这3个材料中不高，但膨大期为4月2日，比39、40号要早10 d，倒秧期要早4～5 d，为早熟材料，同时父本3C是通过分子标记筛选出来的保持系，为全不育型杂交种；39号和40号的产量都达到90000 kg/hm2以上，39号材料叶片生长姿势为半直立向上，而40号为直立向上，更适合密植，在生产中产量有进一步提高的空间。红粉皮洋葱72号(D-9×912)、73号(A1×912)和84号(D-9×911E)的产量分别达到79630.5、82852.5、84600 kg/hm2，3个材料的膨大期和倒秧期基本一致，叶片生长姿势直立向上，都属于中晚熟类型，72和73号的鳞茎球是圆形，84号为扁圆形。

表4 洋葱杂交一代田间性状统计

续表1:

2.3 洋葱杂交种育性分子鉴定

为鉴定目前市场上中日照洋葱杂交种的育性，选取14个国内外主栽品种与2个自主选育品种，每个品种中随机取17株利用orf725对其单株DNA进行分子标记，结果显示16份品种中只有6号帝皇、17号红将军、20号A1×3C和21号T×912 4个全部扩增出833 bp和628 bp两条带，为CMS-T型不育株(图7)，均为全不育型杂交种，其他12份材料为可育株。

图7 洋葱杂交种育性PCR鉴定结果

3 讨论

目前，分子标记辅助选择不育系已直接应用于植物育种中，如水稻[15]、小麦[16]、甘蓝型油菜[17]和玉米[18]等。在洋葱育种中细胞质雄性不育系是解决杂交制种问题最有效的途径之一，自洋葱CMS-S[2]和CMS-T[1]被鉴定以来，开发了Cp-cytotype[19]、cob[3]、atp6和cob-type，orf501[4]，orf725[7]和Cpp1[8]许多不育相关分子标记，以及ACms.1100[19]、jnurf05和jnurf17[20]、jnurf12和jnurf13[9]、OPT和PsaO[12]、WHR240[21]、PMS1[22]、DNF-566和RNS-357[11]、Ms[24]等与Ms[23]位点相关标记并应用于生产中。我国洋葱育种研究起步晚，常规选育不育系耗时长，21世纪以来分子标记的应用加快了我国洋葱不育系及杂交种选育进程。本团队通过分子标记选育了稳定的A1、D-9、A3和T，配制的优良杂交种已在生产中应用；洋葱保持系分子标记的开发能够在优良的父本中筛选出保持系，保证洋葱杂交种的纯度，为全不育型杂交种选育奠定了丰富的材料基础，可直接应用于生产。

国内中日照洋葱杂交品种还很少见报道，大多数引进韩国、日本的杂交种。以本课题组选育的两个黄皮洋葱的不育系A1和D-9为目标，进行群体杂交，23、39、40、72、73和84号为候选杂交组合，23号为黄皮早熟全不育型杂交种，市场急需早熟中日照品种弥补空缺；40号叶片长势直立，产量较高，为中晚熟品种。在粉红色洋葱中，84号虽然为偏扁球形，但在市场中还占有一定的分量，在江苏及周边中日照洋葱栽培地区，红皮扁球形逐步被红皮圆球形代替，但有些消费者习惯红色扁球洋葱。根据近几年洋葱种子市场需求发现，球形基本以圆球形为主，红皮洋葱中，以皮色深紫色为主，进口的洋葱杂交种中，多数为红粉色为主，产量虽然比国内常规种高，但是农户利润低，如本课题组选育的常规种连葱11号(紫玉88，苏鉴洋葱201501，中晚熟、高球形、深紫色)[24]，葱球市场批发价要比国外杂交种高，且种子供不应求。杂交组合中72、73和84号产量虽然较高，但从市场角度看，粉红色并不是最受欢迎；而全不育型杂交种的开发能够解决皮色、品种保护问题，2018年新引进的14个和本课题组2个杂交种中，通过分子标记苗期检测，帝皇、红将军、A1×3C和T×912为全不育杂交种。在甘蓝型油菜杂交种中利用分子标记辅助筛选恢复系，可以提高选育获得强优势杂交组合的效率[25]，所以在今后洋葱杂交育种中，利用分子标记辅助筛选优良保持系、不育系和全不育型杂交组合将成为主流方向。