Mxr1磷酸化水平受Ptp调控机理的初步研究

侯成林 杨艳坤 陈嘉荔 白仲虎

（江南大学生物技术学院 碳水化合物与生物技术教育部重点实验室 工业生物技术教育部重点实验室 谷物发酵技术国家工程实验室，无锡 214122）

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris，P. pastoris）是甲醇酵母。甲醇为单一碳源时，P. pastoris胞内的醇氧化酶 1（Alcohol oxidase 1，Aox1，EC1.1.3.13）能高效催化甲醇氧化成甲醛，同时 Aox1可达到细胞干重的30%［1-2］。利用高效的Aox1启动子（aox1promoter，Paox1）启动外源蛋白的表达，成功构建了巴斯德毕赤酵母表达系统，该表达系统是目前应用最广泛的重组蛋白表达系统之一［3-4］。然而P.pastoris甲醇的代谢存在碳源阻遏现象，即葡萄糖、甘油等碳源的存在可以阻遏甲醇的代谢，Paox1在甲醇为唯一碳源时被激活，在甘油存在时被抑制［5］。甘油代谢和甲醇代谢之间调控的分子机理尚不十分清晰，Paox1的激活和抑制是其研究的核心。

目前已发现多个调控Paox1的转录因子［6-7］，其中甲醇表达调控因子1（Methanol expression regμLator 1，Mxr1，GenBank：ABD57365.1）是最重要的Paox1激活因子，Mxr1的缺失会导致P. pastoris无法利用甲醇［8-9］。研究表明，Mxr1是组成型表达，但是，在甲醇为唯一碳源的培养基中转录激活活性；在甘油培养基无活性［3，10］。同时发现Mxr1上存在磷酸化的Ser215位点，能够调控Mxr1转录激活活性［8］。说明Mxr1功能的发挥主要受磷酸化修饰调节。但是对Mxr1去磷酸化的酶一直尚未发现，本文在研究与Mxr1相互作用的蛋白中找到了使Mxr1去磷酸化的酶—蛋白质磷酸酪氨酸磷酸酶（Protein phosphotyrosine phosphatase，Ptp），并发现该酶对Mxr1的磷酸化水平的调节有明显的调控效果。蛋白质磷酸酪氨酸磷酸酶是一种比较保守的低分子量的磷酸酶［11-12］，而蛋白的磷酸化和去磷酸化对蛋白活性的调节发挥重要作用［13］，推测蛋白质磷酸酪氨酸磷酸酶调控Mxr1磷酸化，进而调控Mxr1活性。

1 材料和方法

1.1 材料

LA Taq DNA聚合酶、内切酶（EcoRI、XhoI、SacI）、T4 DNA 连接酶、卡那霉素、博来霉素、四环素，分光光度计（上海美诺达仪器有限公司），凝胶成像仪，蛋白质电泳仪（北京六一仪器），PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司）。

1.1.1 菌株和质粒 巴斯德毕赤酵母（P. pastoris）GS115、pGAPZB毕赤酵母表达载体、大肠杆菌E.coliDH5α，E. coliBL21，pSVT7大肠杆菌表达载体（表 1）。

1.1.2 培养基 LB培养基（酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、1×105Pa 灭菌20 min，固体培养基添加2%琼脂粉）、LLB培养基（酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、1×105Pa灭菌20 min，固体培养基添加2%琼脂粉）、BMY培养基（酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH6.1，1×105Pa灭菌20 min，无菌酵母无氨基酸氮源YNB 13.4 g/L，无菌生物素0.4 mg/L，碳源按照实验要求后续添加）、YPD培养基（酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、115℃灭菌30 min，固体培养基添加2%琼脂粉）。TB/SB培养基酵母提取物13 g/L、胰蛋白胨 24 g/L、 甘 油 10 g/L、KH2PO423.1 g/L、K2HPO412.55 g/L，1×105Pa灭菌 20 min。

表1 实验所用菌株及表型

1.1.3 引物 本研究所用到的引物（表2）由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 磷酸酶Ptp高表达载体的构建及宿主转化 以GS115基因组为模板，PCR扩增ptp片段，纯化，用KpnI，NotI分别双酶切片段和pGAPZB质粒，分化纯化回收，用T4连接酶链接片段和载体，得到ptp高表达载体PGAP-PTP，转化感受态E.coliDH5α，然后用含有博来霉素的LLB平板筛选和PCR菌落鉴定，并送苏州金唯智生物科技有限公司测序，保存测序正确的菌株。挑选重组子单菌落接种于YPD液体培养基培养24 h，提取基因组，用引物zecin-f，zecin-r扩增博来霉素基因。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，检测PGAP-PTP在P.pastoris染色体的整合情况。筛选到的重组子命名为PTP-GS115。

1.2.2 利用CRISPR/Cas9系统敲除磷酸酶ptp及构建Mxr1S215A定点突变菌株 利用本实验室构建好的基因编辑系统，设计3条sgRNA，电转cas9-GS115感受态，经过PCR，测序验证，在48碱基处成功敲除1个碱基，命名为ΔPTP-GS115。构建定点突变的上下游500 bp同源臂，通过融合PCR，形成上游同源臂定点突变下游同源臂序列，在突变位点上下200 bp左右设计3条sgRNA，构建sgRNA质粒，电转Cas9-GS115通过PCR验证敲掉的碱基数和定点突变。培养P.pastoris细胞、提取基因组及总蛋白质参照Invitrogen公司操作手册。

表2 实验所用的引物及sgRNA序列

1.2.3 荧光定量PCR检测Mxr1不同突变体下游基因表达量 将保存于YPD平板的突变菌株GS115和野生型GS115接种于YPD液体培养基进行过夜活化，统一OD600=0.5用无菌PBS洗3次，接种与含有1%甲醇为碳源的BMMY培养基，在30℃、230 r/min下培养24 h，36 h收集菌体，PBS清洗1次，提取RNA，反转成cDNA，荧光定量检测下游基因表达量。

1.2.4 Ptp诱导表达 通过NCBI数据库报道的ptp基因序列，由苏州金唯智生物科技有限公司对ptp序列进行密码子优化，6His-PTP连到pSVT7载体，转化感受态E.coliBL21，保存菌株。接种LB（15 μg/mL 四环素）的液体培养基，37℃，230 r/min培养过夜（14 h）。测定OD600，并按照初始0.1接种于TB/SB（含15 μg/mL 四环素）培养基中，30℃，230 r/min培养5 h，然后加入不同体积的IPTG进行诱导23℃，230 r/min培养16 h，收集菌体。超声波破碎细胞，提取总蛋白，磷酸酶的Ptp Western blot检测，总蛋白SDS-PAGE电泳后，使用电转仪将蛋白条带转移至PVDF膜上，TBST清洗3次，每次5 min。使用5%的脱脂奶粉封闭1 h，加入HRP标记的鼠抗His6抗体（1∶10 000），室温孵育1 h，TBST清洗3次，每次5 min，使用化学发光的方法显影，曝光时间 1 s［14-15］。

1.2.5 Ptp蛋白纯化 将pSVT7PTP-BL21（DE3）按照最优的发酵条件进行诱导表达，5 500 r/min收集菌体，加入与培养基等体积的上样缓冲液（20mmol/L NaH2PO4·2H2O、50 mmol/L NaCl，pH = 8.0）重悬。冰上预冷后进行超声破碎，破碎时间25 min，8 800 r/min离心收集上清。将上清用0.22 μm针头式滤器进行过滤，作为待纯化的样品。实验采用AKTA-purifier 蛋白纯化仪进行纯化，将滤出液经过Ni agarose蛋白纯化柱进行亲和层析，使用上样缓冲液平衡5CV以洗去未结合的杂蛋白质，再用洗脱缓冲液（20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，50 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，pH8.0）洗脱，收集洗脱峰。将收集的蛋白质进行SDS-PAGE检测。将最优条件下发酵纯化的Ptp分装保存于-80℃［16］。

1.2.6 蛋白磷酸酶Ptp酶活验证 磷酸化多肽为底物，在蛋白金属磷酸酶（PMP）缓冲液。添加1mmol/L MnCl2，反应缓冲液，30℃温育30 min，反应体系如表3，ELISA检测反应产物，反应液包板4℃过夜，使用1%BSA的PBST室温封闭1 h，PBST洗板5遍，孵育相对应的磷酸化抗体，室温2 h，PBST洗板5次，室温孵育HRP标记的兔抗二抗1 h，PBST洗板5遍，加入TMB室温20 min，1 mol/L硫酸终止反应，多功能酶标仪检测结果。

1.2.7 Mxr1磷酸化检测 YPD过夜活化，OD=0.5转接BMMY和BMGY，24 h，按照 1.2.3的方法取样，统一OD600=4收集菌体，提取蛋白，经过Bradford法蛋白质定量，之后进行SDS-PAGE电泳后，使用电转仪将蛋白转移至PVDF膜上，TBST清洗3次，每次5 min。使用1%的BSA封闭1 h，P215磷酸化抗体（1∶2 000），4℃孵育过夜（14 h），TBST清洗3次，每次5 min，室温孵育HRP标记的兔抗二抗1 h使用化学发光的方法显影，曝光时间1 min。

表3 ELISA不同实验中反应类型

2 结果

2.1 Ptp与Mxr1相互作用

为了寻找与Mxr1相互作用的蛋白，我们将Mxr1前400氨基酸与GST标签蛋白，表达纯化，将靶蛋白- GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，用分别在甲醇和甘油培养的GS115蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”（目的蛋白），洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳，切胶，经过质谱分析，得到其中一个蛋白为Ptp（图1）。

图1 Mxr1 PULL-DOWN 结果及Ptp条带

2.2 验证Ptp功能

为验证Ptp的去磷酸化功能，在大肠杆菌表达，诱导表达纯化脱盐后，经BCA法测得蛋白浓度是0.98 mg/L，以不同浓度pNPP为底物，相同体积酶反应30℃，10 min，1 mol/L硫酸钠终止反应，405 nm测吸光强度，测得Ptp米氏常数Km= 2.023 mmol/L，最适酶促反应温度40℃，最适pH4.5（图2）。

通过ELISA检测酶促反应结束后底物剩余量，将酶促反应的底物包板，每孔包被5 mg磷酸化抗原多肽，或非磷酸化抗原多肽，孵育磷酸化抗体（稀释比例 是 1∶2 000；1∶4 000；1∶8 000），通过加入纯化的Ptp蛋白和只加入蛋白洗脱液对比（图2-E），同样的反应条件，发现加入Ptp的样品几乎没有磷酸化抗原多肽剩余。说明纯化出的Ptp蛋白有去磷酸化的蛋白活性。

2.3 Mxr1磷酸化情况

按照1.2.4的方法取样，收集菌体，统一OD600=4收集菌体，提取蛋白，经过BCA法蛋白质定量，之后进行总蛋白SDS-PAGE电泳后，使用电转仪将蛋白转移至PVDF膜上，孵育P215磷酸化抗体（1∶2000）使用化学发光的方法显影，如图3野生型GS115在甘油培养基里没有发生磷酸化，在甲醇培养基里发生磷酸化，而Ptp高表达无论在甘油还是甲醇培养基都不发生磷酸化。

2.4 Mxr1定点突变和敲除在甲醇培养基中对与甲醇代谢相关基因的调控

敲除Mxr1后在BMMY培养基中Aox1几乎不转录，与甲醇代谢相关的酶的转录水平严重下降，将磷酸化位点定点突变后，与甲醇代谢相关酶的基因表达量也有所下降，说明Mxr1的磷酸化修饰调控下游基因的表达，尤其是与甲醇代谢相关的基因的表达（图4）。

3 讨论

Aox1启动子受甲醇诱导，但是其诱导机制到目前为止还没有完全揭示清楚，而Mxr1是毕赤酵母Aox1启动子的必要转录激活因子，为了研究甲醇的激活机理，先研究Mxr1激活机理，通过PULLDOWN发现与Mxr1相互作用的磷酸水解酶 Ptp，并对Ptp进行了高表达和敲除，发现在甲醇培养基中，高表达菌株Mxr1磷酸化程度远远高于敲除菌株。说明Ptp调控Mxr1磷酸化修饰。

本实验用Mxr1特定位点磷酸化多肽作为底物，发现Ptp识别Mxr1S215位丝氨酸位点的磷酸化，并将该位点磷酸基团去除。将Mxr1S215位丝氨酸突变成丙氨酸后，通过荧光定量PCR检测Mxr1野生型，敲除，定点突变菌株的下游基因表达量，发现与甲醇代谢相关的基因转录水平发生了改变，其中Aox1、Aox2、Das1、Das2定点突变菌株转录量相对于野生型的下降接近60%。以上说明Mxr1 S215位磷酸化修饰，影响与甲醇代谢相关基因的转录水平。蛋白的磷酸化修饰与蛋白的结构，亚细胞定位，功能息息相关［17-18］。Mxr1磷酸化修饰对其蛋白活性的影有可能是通过影响Mxr1空间结构，进而影响Mxr1蛋白活性。

在酿酒酵母中，Ptp作为一个高度保守的小分子蛋白磷酸酶，在AMPK途径发挥重要作用［12］，根据小分子磷酸酶的特性推测其底物有可能不止Mxr1一个，需要通过PULL-DOWN找与Ptp相互作用的蛋白。寻找在甲醇代谢通路中Ptp底物，从这些底物磷酸化修饰入手，揭示甲醇诱导代谢途径所在的细胞信号通路。需要进一步验证Mxr1第215位丝氨酸磷酸化与其亚细胞定位是否相关，Mxr1磷酸化修饰是否控制Mxr1进出细胞核，还是调控Mxr1的活性，同时寻找Mxr1其他磷酸化位点，进而揭示Mxr1激活Aox1转录的分子机理，以及甲醇诱导Aox1转录机理。最终减少甲醇的用量，提高利用Aox1启动子表达外源蛋白生产工艺的优化及表达量。

图2 Ptp蛋白外源表达纯化后的酶学性质研究

图3 在分别用甲醇和甘油为唯一碳源培养时，野生型，高表达和敲除菌株的磷酸化水平

4 结论

本研究发现与Mxr1相互作用的磷酸酶 Ptp，验证Ptp的功能是去除Mxr1S215位丝氨酸位点的磷酸基团。将Mxr1S215位丝氨酸突变成丙氨酸后，发现Aox1、Aox2、Das1、Das2定点突变菌株转录量相对于野生型的下降约60%。以上说明Mxr1 S215位磷酸化修饰，影响与甲醇代谢相关基因的转录。

图4 Mxr1磷酸化修饰对甲醇代谢相关基因表达的影响