基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术快速解析杜仲颗粒化学成分

马永青，王 璐，刘 颖，李欣欣，刘永利*

(1.河北省药品检验研究院，河北 石家庄 050011；2.河北省食品药品审评认证中心，河北 石家庄 050011；3.中国药科大学 中药学院，江苏 南京 210009)

杜仲颗粒执行国家食品药品监督管理总局药品标准(WS3-B-1938-95)，由杜仲和杜仲叶饮片组成。该方具有补肝肾、强筋骨、安胎和降血压的作用，可用于治疗肾虚腰痛、腰膝无力、胎动不安、先兆流产和高血压症。杜仲与杜仲叶饮片均收载于《中国药典》2015年版，两者具有相似的化学成分和药理作用[1]。目前，关于杜仲颗粒的研究仅限于药材鉴别和少数成分的含量测定[2-4]，对于中药制剂中化学成分的鉴别鲜有报道。中药的有效性是中医治疗的优势，但其药效物质基础不清是阻碍中药发展的关键问题。杜仲颗粒含有多种活性成分，仅掌握少数化学成分不能全面控制其质量、反映临床疗效，因此有必要建立一种全面分析杜仲颗粒化学成分的快速、灵敏的方法。

超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱组合式高分辨质谱(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)是基于LTQ的多级质谱功能及Orbitrap高分辨能力的一种分析方法[5-6]，具有高灵敏度、高分辨率和精确相对质量测定等优点，尤其适用于缺乏对照品的中药复杂体系定性鉴定及新化合物发掘。本研究利用LTQ-Orbitrap-MS负离子模式采集，各成分的一级全扫描离子在离子阱内进行诱导碰撞解离(CID)模式的多级质谱分析，与傅立叶变换静电场轨道阱(FT Orbitrap)提供的高分辨质谱信息相结合，既实现了UPLC技术对复杂成分快速分离的优势，又能获得高分辨质谱信息，达到快速分析鉴定未知成分。采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS建立了杜仲颗粒化学成分的综合定性分析方法，并对各成分的质谱裂解规律进行总结，为深入阐述其药效物质和建立质量控制体系提供了依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱质谱联用仪，配备Dionex UltiMate 3000 UPLC仪，LTQ Orbitrap Elite质谱仪(美国Thermo公司)；电子分析天平(Mettler XPE 26型，瑞士Mettler Toledo 公司)；数控超声波清洗器(Elmasonic P300 H型，德国Elma公司)；超纯水仪(美国Millipore公司)。

京尼平苷酸(批号：111828-201403)、绿原酸(批号：110753 -201415)、松脂醇二葡萄糖苷(批号：111537-201706)、梓醇(批号：110808-200407)、咖啡酸(批号：110885-200102)，购于中国食品药品检定研究院；紫云英苷(批号：17042715)购于上海纯优生物科技有限公司；乙腈、甲酸(色谱纯，Merck KGaA公司)，实验用水为超纯水。杜仲颗粒样品由生产厂家提供。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的制备供试品溶液：将杜仲颗粒研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加25 mL甲醇，超声处理30 min，放冷，摇匀，过滤，取续滤液即得。

对照品溶液：取京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、梓醇、咖啡酸和紫云英苷对照品，精密称定，分别置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度，制备单一对照品储备液。

1.2.2 UPLC-LTQ-Orbitrap分析条件色谱柱为Thermo Scientific Syncronis C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液；梯度洗脱程序：0～35 min，5%～70%乙腈；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

图1 杜仲颗粒的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of Duzhong granulesthe peak numbers denoted were the same as those in Table 1

电喷雾离子源(ESI)，负离子模式检测，喷雾电压为3.5 kV，鞘气流速为35 L/min，辅助气流速为10 L/min，毛细管温度为300 ℃，离子源温度为350 ℃。鞘气和辅助气均为高纯氮气(纯度>99.99%)，碰撞气为高纯氦气；采用傅立叶变换高分辨全扫描方式(Full scan)，分辨率为60 000，质量扫描范围m/z50～2 000；多级质谱采用数据依赖式扫描(Dependent scan)，CID模式，碰撞能为35%。

2 结果与讨论

2.1 杜仲颗粒化学成分的鉴定与分析

取杜仲颗粒样品，将供试品溶液按“1.2.2”分析条件进行测定，得到负离子模式下的总离子流图(如图1)。进样前用标准溶液校准Orbitrap质量数，供试品溶液通过分析器进行全扫描，质谱触发方式为数据依赖模式，选择上一级碎片进行诱导碰撞解离，利用Orbitrap获得杜仲颗粒提取液中各色谱峰的保留时间、准分子离子峰及MS/MS碎片离子精确相对分子质量信息。结合文献数据、部分对照品质谱信息及相关数据库，对杜仲颗粒进行质谱数据解析，通过高分辨质谱信息推导其可能的分子结构。从杜仲颗粒中共定性鉴别出25种化合物，包括8种环烯醚萜类、8种黄酮类、5种苯丙素类、3种木脂素类化合物及1种非还原性双糖(见表1)。

表1 杜仲颗粒化学成分的质谱信息Table 1 Mass spectrum informations of chemical constituents in Duzhong granules

*identified by comparing with reference standards

2.2 环烯醚萜类化合物的鉴定

通过比较出峰时间及分析质谱裂解规律，结合参考文献及对照品数据信息，在负离子模式下从杜仲颗粒中共鉴定出8种环烯醚萜类化合物，包括杜仲醇苷、京尼平苷酸、京尼平、车叶草苷酸、去乙酰车叶草苷酸、梓醇、雷扑妥苷和苦参碱B。根据二级质谱信息及文献报道，推测环烯醚萜类化合物的主要裂解途径为首先失去母环上的功能基团，如中性丢失H2O、CO2、CH3COOH和糖单元等部分，其次是二氢吡喃环和糖环(葡萄糖)的断裂[7]。

图2 车叶草苷酸在负离子模式下的二级质谱图(A)及可能的裂解途径(B)Fig.2 ESI-MS2(-) spectrum(A) and proposed fragmentation process(B) of asperulosidic acid

图3 槲皮素-3,4′-二葡糖苷在负离子模式下的二级质谱图(A)及可能的裂解途径(B)Fig.3 ESI-MS2(-) spectrum(A) and proposed fragmentation process(B) of quercetin-3,4′-O-di-beta-glucopyranoside

化合物4在负离子模式下的准分子离子为[M-H]-m/z431.119 69，确定其分子式为C18H24O12，进行CID模式产生了m/z251.056 53、269.067 08、225.077 18等碎片离子(图2)。二级质谱中发生糖苷键断裂，中性丢失葡萄糖残基(162 u,Glc)或葡萄糖(180 u,Glucose)，推测离子m/z269.067 08(431.119 69-Glc)和m/z251.056 53(431.119 69-Glucose)均由此产生。碎片离子m/z225.077 18是由前体离子m/z269.067 08脱去CO2分子形成。根据环烯醚萜类化合物的相对分子质量规律推测化合物4为车叶草苷酸。化合物1的结构与车叶草苷酸类似，仅脱去1分子乙烯酮得到，推测其为去乙酰车叶草苷酸。化合物3的准分子离子[M-H]-m/z373.113 92脱去葡萄糖残基得m/z211.061 54，再脱去1个羧基得到m/z167.091 69，经与对照品比对确定其为京尼平苷酸。化合物5在负离子模式下的准分子离子峰[M-H]-m/z361.150 60失去葡萄糖残基(Glu)，形成母核碎片m/z199.097 81，进一步失去1个水分子得到m/z181.087 27[M-H-Glu-H2O]-[8]，经与对照品比对确认其为梓醇。

2.3 黄酮类化合物的鉴定

黄酮类化合物为杜仲颗粒的主要有效成分之一，在负离子模式下，根据质谱信息共推测出8种黄酮类化合物，包括山柰酚-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-葡萄糖苷、山柰酚、紫云英苷、莰菲醇-3-O-芸香糖苷、Peltatoside、异槲皮素、槲皮素-3,4′-二葡糖苷和化合物25。该类化合物在质谱高能量碰撞下连续苷键的裂解方式主要为脱去葡萄糖残基，形成黄酮苷元结构[9]。

化合物11的准分子离子为[M-H]-m/z447.092 44，确定其分子式为C21H20O11。二级质谱中母离子丢失1个葡萄糖残基(162 u,Glc)，得到碎片离子m/z285.040 89，由黄酮类化合物的裂解规律推测其为紫云英苷。化合物13的准分子离子峰为[M-H]-m/z595.130 68，确定其分子式为C26H28O16，二级质谱中母离子丢失五碳糖残基(132 u)，得到碎片离子m/z463.089 17，进一步丢失葡萄糖残基(162 u,Glc)，得到碎片离子m/z301.035 71，推测为化合物Peltatoside。化合物15的准分子离子峰为[M-H]-m/z625.140 56，分两步丢失2个葡萄糖残基(162 u,Glc)，分别得到碎片离子m/z463.088 20与m/z301.035 55。根据其裂解方式(如图3)，提示化合物15为槲皮素-3,4′-二葡糖苷。化合物25的准分子离子峰为[M-H]-m/z757.182 01，确认其分子式为C32H38O21，进行CID模式产生了m/z595.132 39(757.182 01-Glc)、m/z462.082 15(595.132 39-C5H9O4)、m/z300.027 56(462.082 15- Glc)等碎片离子。

2.4 苯丙素类化合物的鉴定

苯丙素类化合物是形成木脂素的前体，普遍存在于杜仲根皮及绿叶中[10]。本研究从杜仲颗粒中共鉴定了5种苯丙素类化合物，分别为咖啡酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸A。其中，绿原酸为《中国药典》2015年版中杜仲叶薄层色谱鉴别及含量测定的指标成分。

图4 新绿原酸在负离子模式下的二级质谱图(A)及可能的裂解途径(B)Fig.4 ESI-MS2(-) spectrum(A) and proposed fragmentation process(B) of neochlorogenic acid

图5 松脂醇二葡萄糖苷在负离子模式下的二级质谱图(A)及可能的裂解途径(B)Fig.5 ESI-MS2(-) spectrum(A) and proposed fragmen-tation process(B) of pinoresinol-di-O-β-D-glucopyranoside

化合物17的准分子离子峰为[M-H]-m/z353.087 83，裂解得到咖啡酰残基碎片离子m/z179.035 46，而后咖啡酰基失去1分子CO2得到碎片离子m/z135.045 65；另一裂解方式则得到碎片[M-H]-m/z191.056 55，而后失去1分子H2O，得到m/z173.046 04，推测该化合物为新绿原酸(如图4)。绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A与新绿原酸的裂解规律相似，参考文献[11]，根据出峰顺序判定绿原酸的各同分异构体。化合物20的准分子离子峰为[M-H]-m/z179.034 67，在负离子模式下裂解产生m/z135.045 49的离子碎片，经与对照品比对确定其为咖啡酸。

2.5 木脂素类化合物的鉴定

木脂素为苯丙素氧化聚合而成的天然产物，通常指其二聚物，少数可见三聚体、四聚体，与糖结合成苷而存在于植物的木部与树脂。木脂素的分子结构较为对称，二级碎片中易脱去葡萄糖残基，以松脂醇二葡萄糖苷为例说明其裂解途径。化合物22的准分子离子峰为[M-H]-m/z681.239 87，其二级质谱裂解主要失去1个葡萄糖残基，得到碎片m/z519.190 67，进一步裂解得到苷元碎片m/z357.135 13，经与对照品比对确定其为松脂醇二葡萄糖苷(如图5)。另外，杜仲颗粒鉴定出的木脂素类化合物还包括原儿茶酸-4-葡萄糖苷和Olivil-O-β-D-glucopyranoside等。

3 结 论

本研究采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS共鉴定出杜仲颗粒的25种化学成分，包括8种环烯醚萜类、8种黄酮类、5种苯丙素类、3种木脂素类化合物及1种非还原性双糖；6种成分经与对照品比对而准确鉴定，其中D-(+)-海藻糖、槲皮素-3,4′-二葡糖苷、Peltatoside和化合物25在杜仲及杜仲叶中为首次报道。以上成分，黄酮类化合物具有止咳、平喘、抗氧化和调节心血管系统等作用；松脂醇二葡萄糖苷、咖啡酸和京尼平苷酸为降血压及抗衰老的重要成分[12-13]，绿原酸具有广泛抗菌、抗病毒功效[14]，不同种类的药物活性成分可协同使杜仲颗粒发挥补肝肾、降血压等作用[15]。结果表明，UPLC-LTQ-Orbitrap-MS可高效、系统地对杜仲颗粒中的化学成分进行快速定性研究，可从整体上阐明杜仲颗粒的化学组成，为深入研究其药效物质基础和质量控制方法提供了依据。