七叶皂苷钠对糖尿病模型大鼠血-视网膜屏障损伤的保护作用及机制研究

陈 珍 俞颂平 李 俊 兰淑琴

糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）为50岁以上糖尿病患者的主要致盲原因，是糖尿病的重要并发症之一。循环高血糖状态造成机体微血管循环障碍，损伤血管内皮细胞，从而引发微血管瘤、出血、渗出、水肿、新生血管形成、黄斑囊样水肿，以及玻璃体出血、视网膜前出血等一系列的眼底病变。病变早期主要以改善微循环治疗为主，但药物选择有限，晚期以视网膜光凝术以及玻璃体切割手术为主，但手术后患者丧失部分视力、视野，给患者带来永久伤害。

七叶皂苷钠从七叶树果实婆罗子中提取的有效成分，具有抗氧化、抑制炎症反应[1-2]。研究表明，七叶皂苷钠通过减少细胞消耗三磷酸腺苷，维持血管内皮功能，减轻黄嘌呤氧化酶活性而减少氧自由基对机体的作用，进而稳定血脑屏障，保护神经作用[3-4]。本研究制备糖尿病大鼠模型，观察七叶皂苷钠对糖尿病大鼠血-视网膜屏障的保护作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康的成年雄性（SD）大鼠（温州医科大学实验动物中心提供[SCXK（浙）2010-0044]），约8～12周龄，体质量180～220g之间，在普通的环境下（恒温18～23℃，通风，湿度60%）饲养，喂以普通饲料，自由饮水。

1.2 主要药物与试剂 注射用七叶皂苷钠（ESC）购自山东绿叶制药有限公司，批号2006051329（D1）；链脲佐菌素（streptozotosin，STZ），批号CAS18883-66-4、伊文思蓝（Evansblue，EB），批号 CAS314-13-6，购自美国sigma公司；甲酰胺、SDS购自上海生工生物工程有限公司；p-MLC单克隆抗体[3675s]购自Signaling公司；Occludin单克隆抗体、Rock单克隆抗体购自SANTA CRUZ公司；柠檬酸、柠檬酸三钠、多聚甲醛、水合氯醛购自国药试剂；ECL化学发光液购自Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 造模及分组 将禁食12h的大鼠按体质量（45mg/kg）一次性尾静脉注射新鲜配制并预冷的链脲佐菌素柠檬酸钠缓冲液（pH=4.5），诱导糖尿病模型，注射完毕后观察2h，开始饮食。连续3天。正常小鼠给予相同体积生理盐水做为对照。3天后尿糖（+++）以上，空腹血糖16.00mmol/L以上，并出现多饮、多尿、多食等症状即认为造模成功，然后随机分为糖尿病组和七叶皂苷钠组，每组6只。ESC组大鼠每日定时 ESC 灌胃，剂量为 1.5mg·kg-1·d-1，连续 12周，每4周监测血糖和体质量，各组采集6只大鼠数据。每4周，水合氯醛麻醉大鼠，每组随机取2只大鼠眼球（12只眼），用作后续实验。

1.3.2 大鼠视网膜组织EB渗漏值检测 腹腔注射水合氯醛（50mg/kg）麻醉大鼠，1min内尾静脉注入EB溶液（45mg/kg），循环2h后，颈静脉灌注生理盐水（37℃）2min，即刻取出眼球，检测EB渗漏值。

1.3.3 Western blot检测视网膜组织occludin、ROCK和P-MLC蛋白表达量 摘取大鼠眼球，显微镜下分离出视网膜组织，TBS与蒸馏水反复冲洗，加入细胞裂解缓冲液，于冰上超声匀浆，匀浆液于低温（4℃）离心机（1-14型，美国sigma公司）离心30min，12000r/min，取上清液，蛋白定量，上样，转膜，封闭，加入一抗于室温微摇2h，用PBS洗涤3次，转入TBS溶液中，室温微摇10min；与二抗室温微摇1h，用TBS洗3次后，加入ECL化学发光液反应1-3min，置于凝胶成像系统拍照。

1.4 统计学方法 应用SPSS14.0统计软件处理数据，计量资料以均数标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血糖及体质量比较 糖尿病组与正常对照组大鼠在各时间点血糖水平变化差异有统计学意义（P<0.01），模型组大鼠成模后，血糖水平稳定，ESC给药对血糖未见影响。七叶皂苷钠组大鼠体质量与正常组比较则稍有下降，但明显比糖尿病组好，差异有统计学意义（P<0.01），ESC给药对糖尿病大鼠体质量维持有正面影响。见表1-2。

表1 各组大鼠血糖水平比较（mmol/L，

表1 各组大鼠血糖水平比较（mmol/L，

注：与同期正常组比较，*P<0.01；DM组：糖尿病组；ESC组：七叶皂苷钠组

组别正常组DM组ESC组鼠数666实验0周4.61±0.68 4.52±0.78 4.51±0.97实验4周4.60±0.87 27.16±5.74*28.51±5.61*实验8周4.58±2.61 26.13±5.74*24.53±3.61*实验12周4.61±1.34 26.30±6.43*24.84±4.03*

2.2 各组大鼠血-视网膜屏障对伊文思蓝（EB）渗漏变化 与正常组比较，糖尿病组大鼠视网膜对EB的渗透量显著增多（P<0.01）。七叶皂苷钠组EB渗漏值较糖尿病组明显降低（P<0.01），且于前4周差异最为明显。见表3。

2.3 七叶皂苷钠对DR大鼠视网膜组织occludin蛋白表达量的影响 七叶皂苷钠组大鼠视网膜组织occludin蛋白表达量较糖尿病组大鼠视网膜组织occludin蛋白表达量明显增加（P<0.01），ESC影响大鼠视网膜组织表达Occludin蛋白，在第8周及12周明显。见表4、插页图1。

表2 各组大鼠体质量改变

表2 各组大鼠体质量改变

注：与同期正常组比较，*P<0.01，与同期DM组比较，△P<0.01；DM组：糖尿病组；ESC组：七叶皂苷钠组

组别正常组DM组ESC组鼠数666实验0周202.30±14.56 201.31±15.46 204.52±13.86实验4周261.01±23.80 186.40±15.46*247.03±17.87*△实验8周315.01±21.54 211.64±19.32*285.47±16.86*△实验12周363.83±11.23 242.81±7.75*327.82±14.61*△

表3 各组大鼠视网膜组织对EB渗漏值比较（ng/mg，

表3 各组大鼠视网膜组织对EB渗漏值比较（ng/mg，

注：与同期正常组比较，*P<0.01，与同期DM组比较，△P<0.01；DM组：糖尿病组；ESC组：七叶皂苷钠组

组别正常组DM组ESC组鼠数666实验4周12.34±4.30 26.23±2.00*13.27±0.77△实验8周12.67±2.11 29.78±1.78*18.01±1.77△实验12周12.45±4.40 34.08±3.03*21.05±1.50*△

表4 各组大鼠视网膜组织occludin蛋白表达量比较

表4 各组大鼠视网膜组织occludin蛋白表达量比较

注：与同期正常组比较，*P<0.01，与同期DM组比较，△P<0.01；DM组：糖尿病组；ESC组：七叶皂苷钠组

组别正常组DM组ESC组鼠数666实验4周4.52±0.75 3.59±0.64*4.58±0.53△实验8周4.67±0.81 2.26±0.45*3.65±0.71△实验12周4.45±0.78 1.23±0.47*3.45±0.58△

2.4 七叶皂苷钠对DR大鼠视网膜组织ROCK蛋白/P-MLC蛋白表达量的影响 七叶皂苷钠组大鼠视网膜组织ROCK蛋白、P-MLC蛋白表达量较糖尿病组大鼠视网膜组织ROCK蛋白、P-MLC蛋白表达量明显降低（P<0.01）。见表 5-6，插页图2-3。

表5 各组大鼠视网膜组织ROCK蛋白表达量比较

表5 各组大鼠视网膜组织ROCK蛋白表达量比较

注：与同期正常组比较，*P<0.01，与同期DM组比较，△P<0.01；DM组：糖尿病组；ESC组：七叶皂苷钠组

组别正常组DM组ESC组鼠数666实验4周0.74±0.36 1.45±0.53*1.05±0.49△实验8周0.67±0.81 2.76±0.32*1.84±0.71△实验12周0.81±0.78 3.82±0.49*2.34±0.51△

表6 各组大鼠视网膜组织P-MLC蛋白表达量比较

表6 各组大鼠视网膜组织P-MLC蛋白表达量比较

注：与同期正常组比较，*P<0.01，与同期DM组比较，△P<0.01；DM组：糖尿病组；ESC组：七叶皂苷钠组

组别正常组DM组ESC组鼠数666实验4周0.52±0.23 0.95±0.62*0.71±0.49△实验8周0.61±0.41 1.96±0.59*1.01±0.61△实验12周0.49±0.38 2.67±0.65*1.54±0.51△

3 讨 论

DR早期的标志性病变为BRB的破坏与血管渗透性增加，BRB在调节血管通透性、神经视网膜组织营养物质和氧气的传输中起重要作用[5-7]。高血糖状态下，机体通过激活蛋白激酶C、多元醇、非酶糖基化终产物等通路开启糖尿病性代谢，致使体内氧化与抗氧化系统失平衡，过氧化物产生增加，氧化物清除减少，氧化应激产生，造成机体损伤，视网膜中的多不饱和脂肪酸含量高，对氧及葡萄糖的需求大，高血糖对于视网膜的损伤尤为明显，破坏BRB及提高血管通透性。本研究结果显示，七叶皂苷钠能够减少DR大鼠视网膜组织的伊文思蓝渗漏，能够增加DR大鼠视网膜组织occludin蛋白的表达以及抑制DR大鼠视网膜组织ROCK蛋白/P-MLC蛋白表达，说明七叶皂苷钠具有保护DR大鼠BRB的功效。七叶皂苷钠通过抑制炎性介质释放作用，改善微循环，稳定血管内皮功能，降低毛细血管通透性[8-9]，在本实验中表现为降低视网膜组织的伊文思蓝的渗漏。

Occludin是一种跨膜蛋白，其作用是保持上皮细胞及内皮细胞间结构的完整性，同时形成一种高度极化性的屏障来维持动物体内微环境的稳定[10]。Occludin蛋白受多种机制调控，其中血管内皮生长因子（VEGF）、粘附分子等炎症介质会导致其表达下降，从而影响细胞间的渗透性[11]。有报道显示，Occludin蛋白在DR视网膜组织中表达降低[12-13]。七叶皂苷钠通过降低VEGF表达[14]，增加组织occludin蛋白表达量，与本实验结果相符；禹海[15]等研究发现，糖尿病大鼠视网膜中粘附分子与occuldin蛋白表达呈显著负相关，抑制粘附分子可增加occuldin蛋白表达。根据实验结果显示，七叶皂苷钠通过增加DR大鼠视网膜组织occludin蛋白表达保护DR大鼠BRB。

Rho/ROCK细胞信号通路与血管通透性的调节有密切关联[16]，陈曦等[17]研究发现，高血糖环境诱导Rho/ROCK活化，活化的ROCK上调TNF-α、ICAM-1表达，增加白细胞粘附，引发一系列炎症反应。在本实验发现，当发生糖尿病视网膜疾病时以及在糖尿病视网膜疾病的发生发过程中，ROCK通路一直处于激活状态，而其底物MLC的磷酸化水平也不断地升高，与Arita等[18]研究相符。根据实验结果，七叶皂苷钠能够抑制视网膜组织ROCK蛋白及P-MLC蛋白表达量，考虑七叶皂苷钠通过抑制ROCK/P-MLC通路激活而达到抑制炎症反应的作用，从而保护BRB功能；但其具体作用靶点不得而知，需进一步实验研究，这也是本实验的不足之处。

综上所述，七叶皂苷钠可能通过提升occludin蛋白表达量，抑制ROCK细胞信号转导通路，降低视网膜血管内皮细胞的通透性，稳定BRB功能，阻止糖尿病视网膜病变的发生发展，其具有改善大鼠DR的药效活性。