达氏鳇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及双低菜粕添加对其表达的影响

岳华梅，吴金平，陈细华，阮 瑞，李创举

(农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室，中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223)

近年来，随着鱼粉价格的不断上升，利用廉价蛋白源替代鱼粉已经成为当前鱼类营养与饲料学研究的热点之一[1]。双低菜籽粕是双低油菜籽经制油加工后的副产品。油菜籽中通常含有30%～40%的菜油，经榨取后可产生70%左右的饼粕。但是因其含有多种抗营养因子和毒素，如单宁酸、芥子油甙等, 可影响氨基酸的利用、消化酶的活性、矿物盐的利用，限制了菜粕在鱼类饲料中的使用量[2]。研究表明，乌苏鳢(Pseudobagrusussuriensis)[3]、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[4]和欧洲鳇(Husohuso)[5]对双低菜粕的表观消化率低于鱼粉。这可能是由于双低菜粕属于植物性蛋白原料，其纤维素所占比例较高，而水生动物缺乏消化纤维素的酶系统[6]。当饲料中选用植物性蛋白原料(如双低菜粕)时，其是否影响鱼类的蛋白质代谢目前研究较少。

饲料在体内蛋白酶的作用下水解生成多肽，多肽在肽酶(如氨肽酶N)的作用下水解生成小肽及游离氨基酸，最后被肠道转运载体(如小肽转运载体)吸收进入血液循环系统。谷氨酸脱氢酶(GDH)是蛋白质分解代谢和非必需氨基酸合成的关键酶，其活性与蛋白质合成与分解有直接关系[7]。GDH 是通过催化体内氨基酸氧化脱氨基作用来参与蛋白质的分解，具体作用是催化谷氨酸氧化脱氨基生成α-酮戊二酸和氨，其辅酶是NAD+或NADP，也可以催化其逆反应参与蛋白质的合成[8]。

达氏鳇(H.dauricus)隶属鲟形目鲟科鳇属，主要分布于我国黑龙江阿穆尔河流域，成鱼个体较大，属偏肉食性鱼类。近些年来随着养殖业的发展，达氏鳇及其杂交种也作为经济鱼类在全国范围内开展推广养殖[9]。本团队前期研究表明，达氏鳇幼鱼对双低菜粕的粗蛋白及总氨基酸的表观消化率显著低于鱼粉[10]。本研究旨在克隆蛋白质代谢关键基因谷氨酸脱氢酶，分析其序列及组织表达特征，并试图从分子层面探究双低菜粕是否影响达氏鳇幼鱼的蛋白质代谢途径，以期为菜粕在鲟鱼饲料配方中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

所配制饲料配方及营养成分见表1。实验原料鱼粉和双低菜粕来自武汉大北农水产科技有限公司。所有原料粉碎后过60目筛，在基础饲料中添加0.4%的二氧化钛作为标记物，采用逐级混匀法，均匀混合到基础饲料中，以测定其表观消化率[10]。取70%添加二氧化钛的基础饲料和30%的菜粕，充分混匀后，添加20%左右的水，再次混匀，用小型绞肉机制成直径约3 mm的条状饲料。风扇吹干后，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

表1 基础饲料组成及营养水平(干重)

注：*每千克饲料中含有维生素：VB150 mg，VB2200 mg，VB650 mg，VB1220 mg， 叶酸15 mg，VC(30%) 325 mg，泛酸400 mg，肌醇1500 mg，D-生物素(2%) 5 mg，烟酸750 mg，VA 2.5 mg，VE(50%) 100 mg，VD32 mg，VK 20 mg。

**每千克饲料中含有矿物盐：Ca(H2PO4)21 800 mg，KH2PO41 350 mg，NaCl 500 mg，MgSO4·7H2O 750 mg，NaH2PO4、2H2O 650 mg，KI 1.5 mg，COSO4·6H2O 2.5 mg，CuSO4·5H2O 15 mg， ZnSO4·7H2O 350 mg，FeSO4·7H2O 1 250 mg，MnSO4·4H2O 80 mg，Na2SeO36.00 mg。

1.2 实验鱼养殖及样品采集

达氏鳇幼鱼来源于黑龙江抚远江段野生个体自然繁殖，所得鱼苗随后饲养于长江水产研究所荆州太湖基地。挑选初始体重为(66.79±2.18 g)的达氏鳇幼鱼120尾，随机分养于6个流水养殖桶中(直径105 cm，体积0.43 m3)，每桶放鱼20尾，其中3桶鱼饲喂基础饲料组饲料，另外3桶鱼饲喂菜粕组饲料。经基础饲料投喂2周后，开始用实验饲料投喂，每天表观饱食投喂2次(08:00，15:00)。实验期间采取自然光照，水源为过滤后的地下水，水温18.2～20.0 ℃，溶氧≥5 mg/L，pH 7.8～8.2。实验饲料共投喂4周，取样前对实验鱼进行24 h饥饿处理，然后随机选取4条鱼，经0.05% MS-222(Sigma)麻醉后，解剖取肝脏和肠组织，保存于RNAlater(Qiagen)保存液中，-80 ℃存放备用。组织表达分析所选用达氏鳇为9月龄(体长35 cm，体重585.4 g)，分别取心、肝、脾、肌肉、肠、下丘脑、垂体组织，浸泡于RNAlater(Qiagen)保存液中，-80 ℃存放备用。

1.3 总RNA 提取

采用RNeasyPlus Mini Kit 试剂盒(Qiagen)进行组织总RNA 的提取，并参照PrimeScriptRT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒合成单链cDNA 用于荧光定量PCR分析。

1.4 谷氨酸脱氢酶基因ORF序列克隆及分析

根据实验室已有的达氏鲟下丘脑转录组数据(未发表数据)，搜索得到gdh同源基因的序列片段信息，设计嵌套引物进行PCR 扩增。PCR产物纯化后连入pMD19-T 载体，转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)，挑取阳性克隆进行测序验证。本研究所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成(表2)。采用NCBI Conserved Domain Database对所得序列进行结构域预测(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)。对推导的达氏鳇GDH氨基酸序列与NCBI中查询得到的其它物种GDH序列运用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)进行序列一致性比对，并利用MEGA X 软件以邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统发生树，自展法(Bootstrap)检验系统分支的置信度(重复次数为1 000)。所选取物种GDH氨基酸序列对应的NCBI序列号如下：人(CAA30521.1)、小鼠(EDL24875.1)、西部锦龟(XP_005294054.1)、绿海龟(EMP30951.1)、热带爪蟾(AAH84455.1)、非洲爪蟾(NP_001087023.1)、斑马鱼(NP_997741.1)、泥鳅(AEX31556.1)、黄鳝(AEX31558.1)、大西洋鲑(NP_001117108.1)、虹鳟(CAD11803.1)、罗氏沼虾(ATN39850.1)、中华绒螯蟹(AEO72077.1)、凡纳滨对虾(ACC95446.1)。

表2 实验所用引物序列

1.5 实时荧光定量PCR

根据所得到达氏鳇gdhcDNA 序列设计定量引物(表2)，进行qRT-PCR 反应。达氏鳇apN及pepT1基因的荧光定量引物设计参考自达氏鲟下丘脑转录组数据库搜索得到的相应同源基因的部分片段序列，并进行测序验证。达氏鳇hsp90和18sRNA的荧光定量引物参考文献[11]。实验按SYBRPremix ExTaqTM(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行操作，重复3次，以达氏鳇18S RNA作为内参基因。扩增反应在 Bio-Rad CFX96 Real Time System 仪上进行，反应程序为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环。结果采用2-ΔΔCt分析法进行数据分析。

1.6 统计分析

实验数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，并采用SPSS 22.0对各实验组数据进行单因素方差分析，P<0.05表示差异显著，P≥0.05表示没有显著性差异。使用GraphPad Prism 5.0软件进行制图。

2 结果

2.1 达氏鳇谷氨酸脱氢酶基因的cDNA序列扩增及分析

本研究克隆得到达氏鳇谷氨酸脱氢酶基因gdh的完整ORF序列。该序列全长1 635 bp，编码544个氨基酸。结构域预测发现，达氏鳇GDH拥有两个ELFV_dehydrog超家族结构域(图1，下划线标示)。氨基酸序列多重比对结果表明，达氏鳇GDH的氨基酸序列较为保守，与其它代表性脊椎动物的同源蛋白序列一致性均大于85%(图2)。进一步运用Mega X软件构建了基于GDH氨基酸序列的NJ系统发育树(图3)，结果显示，哺乳类代表物种人和小鼠先与爬行类的西部锦龟聚为一支，然后再与两栖类的热带爪蟾及非洲爪蟾聚为一支，随后这5个物种再与软骨鱼类达氏鳇聚为一类，而所有的硬骨鱼类聚为单独的一支。

图1 达氏鳇gdh的ORF cDNA全长序列及推导的氨基酸序列Fig.1 The full-length ORF cDNA sequences of gdh and their putative amino acidsELFV_dehydrog结构域用下划线标示

2.2 谷氨酸脱氢酶基因gdh的组织表达分析

采用荧光定量PCR法检测了gdhmRNA在达氏鳇各组织(心、肝、脾、肠、肌肉、下丘脑、垂体)中的表达。gdh在所有检测的组织中都有表达，其中在肠中的转录水平最高，在肌肉中的转录水平最低(图4)。

2.3 双低菜粕添加对gdh、apN、pepT1及hsp90基因表达的影响

在基础饲料中添加双低菜粕作为蛋白原料制备饲料投喂达氏鳇幼鱼，检测其对蛋白质代谢相关基因gdh、apN、pepT1及应激反应相关基因hsp90表达的影响。荧光定量PCR分析结果显示，在肝脏中，gdh和hsp90的表达量在菜粕组和基础饲料组没有明显变化(图5A)。而在肠中，菜粕组gdh和apN基因的转录水平显著高于基础饲料组；pepT1基因在菜粕组的表达量虽也高于基础饲料组，但是差异不显著(图5B)。

图2 达氏鳇与其他代表性物种的GDH氨基酸序列多重比对分析Fig.2 Multiple sequence alignment of GDH between H. dauricus and other vertebrates除达氏鳇外，其它所有序列来源于Genbank。相同的氨基酸残基用黑色阴影高亮显示，60%一致的氨基酸残基用灰色阴影表示

图3 采用MEGA X软件构建的基于GDH氨基酸序列的NJ系统进化树Fig.3 NJ phylogenetic tree based on GDH amino acid sequences by MEGA X

图4 达氏鳇gdh基因在不同组织中的表达Fig.4 The transcription distribution of gdh in different tissues of H. dauricus

图5 两种蛋白原料对肝脏gdh、hsp90及肠gdh、apN、pepT1基因表达的影响Fig.5 The transcription differences of gdh and hsp90 in the liver(A) and gdh, apN, and pepT1 in the intestine(B) by the two different protein ingredients diets每组选取4尾鱼进行分析，误差线表示标准差，*代表差异显著(P<0.05)

3 讨论

本研究从达氏鳇中克隆得到谷氨酸脱氢酶基因的ORF序列，氨基酸序列多重比对结果表明GDH在脊椎动物中较为保守，暗示其具有保守的生物学功能。谷氨酸是含量最高的游离氨基酸之一，广泛分布于各种组织中，包括脑、骨骼肌、肝、肾、肠和脂肪等组织中。本研究也发现达氏鳇gdh基因在所有组织中广泛表达(图4)，这与其对谷氨酸的分解代谢功能是相一致的。在凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[12]、明对虾(Fenneropenaeuschinensis)[13]及斑节对虾(Penaeusmonodon)[14]中，gdh在肌肉中大量表达，这可能与甲壳动物的大量氨基酸代谢发生在肌肉中有关。在湘云鲫和红鲫中，gdh在肝脏和前肠中表达量都较高[15]。本研究中达氏鳇gdh在肠中表达量最高，在肝脏组织中也有大量表达。肠道是鱼类氨基酸消化、吸收及转运的主要场所。另外，大量的研究证实GDH在肝脏和肠中的氨氮代谢中也发挥重要作用[12-14]。因此，GDH在肝脏和肠道中的高表达与其参与氨基酸消化及氨氮代谢功能相一致。

热休克蛋白又称为应激蛋白, 包含HSP90、HSP70、HSP60等蛋白家族。它是生物细胞(包括原核细胞及真核细胞)在受热、生物应激、理化因素等应激原刺激后, 发生热休克反应时所产生的一类伴随细胞蛋白[16]。在本研究中，当在饲料中添加双低菜粕时，肝脏中hsp90的表达没有发生变化(图5A)，这说明双低菜粕的添加没有引起达氏鳇鱼体的应激反应。

在本团队前期研究中，达氏鳇对鱼粉组总氨基酸的表观消化率(98.62%±3.86%)显著高于豆粕组(85.68%±3.97%)[10]。为了研究饲料中添加双低菜粕是否会引起达氏鳇蛋白质代谢水平的升高，分别检测了与蛋白质消化相关的gdh、apN基因及多肽转运相关的pepT1基因的表达变化。GDH主要催化谷氨酸的去氨基化，生成副产品氨，参与氮代谢循环。APN属于锌金属肽酶家族的一个成员，属肽链端解，其在肠道中主要参与氨基酸的N端水解，以将小的多肽消化成氨基酸[17-18]。动物肠道小肽转运载体pepT1的主要功能是将小肽从细胞外转运至细胞内，在动物吸收外源小肽中起关键作用[19]。本研究结果显示，双低菜粕组肠道中gdh和apN的转录水平显著高于基础饲料组，pepT1的变化没有显著性差异(图5B)。这说明为了更好地消化植物性蛋白质，达氏鳇体内的蛋白质转录水平得到提高，但是小肽转运过程变化不显著。以上结果暗示，在达氏鳇饲料中添加双低菜粕，需综合考虑其对生长及体内蛋白代谢水平的影响。