猪瘟单克隆抗体诊断技术的推广与应用

麦丽芳

（广东省惠州仲恺高新技术产业开发区农业技术服务中心 516006）

1 单克隆抗体的主要作用

20 世纪初期，细胞融合技术得到第一个单克隆抗体，单抗的问世为各种病害的诊断、预防和治疗提供了强有力的技术措施。经试验比较可以发现，单抗纯度高、活性单一，与抗原结合后能无限繁殖，形成强的特异性，可识别多种新型表位，可识别抗原等优点，在治疗性候选药物及诊断试剂盒开发中发挥关键性作用。

2 猪瘟疫情介绍

2.1 流行病学

猪为猪瘟唯一易感群体，致病病毒可随粪便、分泌物等排到体外，散布在外界形成传染载体。近些年，典型猪瘟病例渐少，而非典型性猪瘟占大多数。临床表现持续感染，隐性传染，混合感染。妊娠母猪感染，多数症状不突出。但会伴发明显的繁殖障碍病。

2.2 临床症状

急性：发病急，高热稽留，突然发病。多数发病后 1～2d即可死亡。此病流行初期便秘，后期下痢。检查排出粪便有大量血丝或黏液。个别病例伴发典型神经症状。

慢性：临床以纤维性坏死性肠炎为典型症状，症状较急性类似，但症状时好时坏。可见症状食欲不振、贫血、消瘦，便秘与腹泻交替出现，皮肤有大小不等的坏死斑。多数病程在30d 以上，个别病例因体质问题导致病情恶化甚至死亡。

2.3 猪瘟的检测

兽医在猪瘟临床诊断中主要根据测试体温、临床发病情况、特点、传播方式、易感动物、死后剖检观察的病理变化可做初步诊断。而确诊需要结合实验室诊断而进行，参见附表。

通常情况下，猪瘟免疫控制阶段以血清学检测为主，监测净化阶段以病原学检测为主。抗体检测用于了解机体免疫功能及猪瘟的免疫保护水平，病原学检测用于确诊猪瘟病毒野毒感染。血清学检测方法优先选用ELISA 方法或其他经试剂比对和有效验证可靠的方法。病原学检测应选用敏感性等于或高于RT-PCR 的方法。

诸多检测应用方法中，猪瘟单克隆抗体在猪瘟防疫各阶段应用的频率最大，而且取得优于多克隆抗体的监测效果。

附表 猪瘟诊断指标和发病情况汇总表

3 关于猪瘟单克隆抗体

抗体是分子识别的重要载体，被普遍应用到各猪病的诊断实践中。而单克隆抗体是通过将抗原注入宿主动物体内启动机体免疫应答而产生的。因而制作单克隆抗体的大多数操作都是在体外将来自这些宿主的脾细胞与培养的恶性骨髓瘤细胞进行融合。将独特的细胞克隆分离出来，融合步骤中存活下来的细胞称为杂交瘤。杂交瘤因骨髓瘤特性而可以永生，且容易在培养物中繁殖。

不同于多克隆抗体，单克隆抗体用于猪瘟诊断体现出不可比拟的优越性：第一，在体外生存环境中，杂交瘤存活时间更长，在传代生长中能持续形成高均一、高特异抗体。第二，提纯不纯抗原，获得高特异的抗体，提升识别检测的准确性。第三，能获得无限量的均一抗体，尤其适合抗体标记的免疫学分析，区别于多克隆抗体检测效果更好。

但也有缺点，第一，单克隆抗体制备成本更高些，技术更复杂，筛选难度更大，使用价格更高。第二，单克隆抗体诊断技术存在明显的局限性，生物活性的亲和性和局限性大大限制其应用范围，尤其不能用于沉淀和凝聚反应的实验室诊断。

4 猪瘟单克隆抗体诊断技术的推广

4.1 基于猪瘟单克隆抗体的猪瘟抗原诊断

张富强等以单克隆抗体为包被抗体，以噬体表位为竞争指示剂，以标记HRP 为检测抗体，由此而建立起的竞争ELISA方法。在后续推广试验中，用于70 份的血清样品监测，证实较国家标准的抗原捕捉ELISA 方法敏感性更高。同时，推广应用的试剂中很多不含有病毒成分，不具有传染性，可作为常规检测方法加以推广。张长弓等用胶体金标识单克隆抗体研发猪瘟胶体金快速监测技术。在推广试验中，该试纸用于弱毒活疫苗和脾淋弱毒苗的检测，均显示为阳性。而其他猪源病毒的检测均显示阴性，证实该试纸用于猪瘟抗原诊断的高敏性。此外，考虑到该单克隆抗体与野毒有很大区别，为在区分野毒抗体方面存在很大差异[1]。陆芹章等用CSFV 单克隆抗体成立抗原诊断方法。在比较一元和二元单抗的检测比较中很好地证实二元的协作能力更强，更有利于捕捉病毒，用于鉴别诊断。De las Mulas 等及Narita 等利用针对E2 糖蛋白的单抗建立了检测福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品中猪瘟病毒抗原的免疫组织化学方法。该方法的优点是能检测长期保存的样品，缺点是比较费时，而且福尔马林固定后的组织不能再进行病毒分离[2]。刘建文等以3 株CSFV 特异性单抗联合作为捕捉抗体，建立了检测CSFV 抗原的AC-ELISA，单抗的联合应用提高了该方法的敏感性，对31 份临床样品进行平行检测，该方法与病毒分离和RT-PCR 方法的符合率分别为86.2%和90.3%。该方法将单抗特异性和ELISA 方法的敏感性有机地结合起来，能短时间内准确、快速、直接检测大批量样品中CSFV 抗原，且明显优于病毒分离和免疫荧光等方法，更适合于各级兽医研究机构和生产单位应用。由于3 株单抗与BVDV 无交叉反应性，也可达到与BVDV 鉴别诊断的目的。

4.2 基于猪瘟单克隆抗体的猪瘟抗体诊断

刘劲松等用酶标记CSFV 抗体建立的竞争ELISAD 法，试验用5 份未吃乳仔猪血清和79 份疫苗注射不同生猪的血清监测。结果显示，注射前血清母源抗体抑制率在50.8%，注射后2 周母源抗体抑制率在60.8%，与HRP-SPA-ELISA 的检测结果呈正相比关系。由此可见，猪瘟病毒抗体检测能准确反应疫苗注射前后抗体水平和免疫水平。梁冰冰等用猪瘟重组E2 蛋白作为竞争抗体，建立一种能有效检测抗体的E2 蛋白竞争抑制ELISA 方法。经试验比较，该检测结果与IDEXX 公司的试剂检测吻合度高达90%以上。同时，测得的抑制率更呈正相关。由此可证实，E2 蛋白竞争抑制ELISA 方法，能更高效定量检测出免疫后的中和抗体水平，适合用于初期抗体水平的流行情况检测。国外学者Claqvijo 等尝试用猪瘟E2 基因表达产物制备单克隆抗体，经该种方法成立的竞争ELISA 方法在临床试验比较的2000 多份血清检测中证实有效的特异性反应和敏感性反应分别达到100%和85%。另外，考虑到该单抗不具备中和性，可用此法推广到猪瘟病的监测和流行病学调查。