‘京白梨’优良单株组织培养高效快繁体系构建

刘 春，高同雨，苏本营，李锦锦，李 晶，武雅娟，王 巍，沈应柏

（1.北京市门头沟区国家生态修复科技综合示范基地，北京 102300；2.淮北师范大学，安徽淮北 235000；3.北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）

‘京白梨’属于秋子梨（Pyrus ussuriensis）的一个优良品种，是北京市地理标识性水果之一，栽植历史悠久，迄今已有400多年。在北京的栽培区域主要包括门头沟区妙峰山镇、军庄镇和房山区琉璃河镇等，在我国的河北、辽宁、山西等地也有栽培。‘京白梨’果实口味细腻独特，是具有重要价值的水果品种，深受广大消费者喜爱。随着‘京白梨’在市场上供不应求，其市场价格也在逐年提高，给北京‘京白梨’产区带来了良好的经济效益。但是由于病害、栽培管理粗放、不注重保存优良种质资源等原因，目前‘京白梨’品种退化日益严重，出现风味变淡、果形较小、畸形果增多等现象[1]，严重制约了其产业化发展，急需通过科学技术手段加快‘京白梨’优良植株繁育。

20世纪30年代，Tukey进行了梨胚胎培养并获得成功[3]。梨及其砧木的繁殖多采用嫁接方法，70年代后关于梨与砧木的组织培养和离体快繁的报道增多，美国和意大利最早使用离体快繁技术对梨及砧木进行商业性生产。1975年，前苏联学者进行洋梨幼胚培养获得植株[3]。David与赵惠祥从茎尖培养中，分别得到试管苗和完整的植株。此外还进行了下胚轴，子叶横切段的培养，都成功获得了不定芽[3]。现阶段梨的组织培养工作主要集中在叶片培养和茎尖培养两个方面。研究结果表明，品种和器官的外植体不同，所采用的培养基种类、植物生长调节剂的比例和浓度、培养条件也不同。不同的培养基条件对梨的组织培养有很大影响，韩继成等[4]通过试验表明，梨的两个品种冀蜜和丰水分别以N6，NN60，MS为培养基，附加相同的条件（TZD1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+CH 250 mg/L+S.30 mg/L+A.5 mg/L），结果在NN60培养基上获得了最佳效果，不定芽的诱导率为100%。

目前对‘京白梨’优良单株组织培养快繁技术的研究报道较少，研究‘京白梨’的组织快繁体系，包括消毒方式、外植体筛选以及增殖和生根培养基配比，具有一定的生产实践意义。通过组培快繁技术获得脱毒苗，可以减少梨树自身潜隐病毒带来的危害，为‘京白梨’优良植株种质资源保存和繁育提供理论基础和技术支撑，同时，也可为解决北京地区‘京白梨’品种退化提供有效途径，从而推动‘京白梨’产业化发展。

1 材料和方法

试验于2018年4月至2019年6月在北京市门头沟区科技开发试验基地组培实验室内进行。

1.1 试验材料

植物材料：选用‘京白梨’优良单株‘孟3’为试验材料，外植体选用枝条水培萌发出的幼嫩芽尖和春季树体萌发的幼嫩新梢。

化学药剂及材料：75%酒精、2%次氯酸钠、琼脂糖、MS培养基、NAA、IBA、IAA、GA3、蔗糖、氢氧化钠、盐酸、蒸馏水、抗坏血酸、活性炭、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、蛭石、营养土。

1.2 试验处理与方法

1.2.1 外植体消毒方式筛选

采集‘京白梨’优株‘孟3’枝条，经水培抽芽后，每个瓶内接种3个‘京白梨’花芽和叶芽，5瓶为一个生物学重复，14 d后观察外植体污染结果。采用2%的次氯酸钠和0.1%的升汞溶液进行消毒处理。

1.2.2 组培外植体筛选

外植体采用带芽的越冬枝条以及水培抽出的花芽，接种到相同的培养基中，观察生长情况，统计污染率。

1.2.3 花芽愈伤组织培养基筛选

采用以下MS和1/2 MS两种培养基配制方法，30 d后观察花芽愈伤组织诱导情况。

表1 不同培养基花芽愈伤组织诱导处理Tab.1 Treatment of callus induction of flower buds in different mediums

1.2.4 ‘京白梨’组培快繁培养基优化

外植体选用‘京白梨’水培萌动的嫩芽，设计不同条件的培养基，包括MS类型，不同激素及浓度处理，通过观察组培苗增殖生根情况，筛选出最优培养基方案（表2、3）。

表2 组培苗增殖不同激素处理Tab.2 Different hormone treatments for proliferation of tissue culture seedlings

1.2.5 数据处理方法

通过Excel 2013进行数据的整理计算；采用DPS 7.05统计软件进行方差分析，采用单因素方差分析各处理差异的显著性水平，采用最小显著差数法（P＜0.05,LSD）进行不同处理间均值的显著性差异比较。

污染率（%）=（污染外植体/接种外植体总数）×100；分化率（%） =（已分化的外植体数/接种外植体总数）×100；增殖率（%）=（处理后的有效芽数/接种外植体总数）×100。

2 结果与分析

2.1 外植体消毒方式对污染率的影响

外植体接种14 d后观察结果，采用2%浓度次氯酸钠的消毒方式污染率为33%，采用0.1%升汞的消毒方式污染率为18%。

表3 不同激素处理下‘京白梨’组培苗生根的培养基Tab.3 Mediums for rooting of tissue culture seedlings of‘Jingbaili’treated with different hormones

2.2 不同外植体的接种对比分析

外植体直接采用带叶芽及花芽的老枝条，经消毒接种到培养基后污染率达到93.3%；而选用新发的花芽及嫩芽试验，污染率为0。‘京白梨’组培试验中外植体的选择应避免使用老枝条，尽量选用刚萌动的嫩梢和花芽。

2.3 不同培养基对花芽愈伤组织形成的影响

在1/2 MS培养基中的‘京白梨’花芽外植体形成的愈伤组织比MS数量多，MS愈伤组织分化率为33.3%，在1/2 MS培养基中愈伤组织的分化率为60%。但是在1/2 MS中的愈伤组织出芽率较低。

2.4 赤霉素浓度对花芽愈伤组织诱导的影响

30 d后观察外植体生长状况，结果表明花芽在3 mg/L（图1b）和1.5 mg/L（图1c）赤霉素浓度中均能诱导出愈伤组织，其中在1.5 mg/L浓度中生长良好，愈伤组织诱导个数较多，45 d后花芽愈伤组织分化出完整植株（图1a）。

图1 不同浓度赤霉素的‘京白梨’培养情况Fig.1 Culture of‘Jingbaili’with different concentrations of GA3

2.5 组培快繁技术培养基的优化

2.5.1 激素处理浓度对嫩梢外植体愈伤组织增殖的影响

不同处理间组培苗生长情况（表4），愈伤组织个数以T3、T9处理最高，约10个，其次为T6、T4处理，约为9个，与CK相比具有显著性差异；不定芽个数以T6处理最高，约为14个，其次为T3，约为13个，与CK相比具有显著性差异；增殖率以T6、T3处理最高，分别为94%、92%，显著高于CK；芽长度以T2、T4、T5处理最大，均为0.58cm，与CK相比具有显著性差异。

综合以上指标以及组培苗后期生长情况（表5），采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3培养基最有利于组培苗增殖。

表4 不同激素处理对‘京白梨’外植体组培苗生长影响Tab.4 Effects of different hormone treatments on explants growth of‘Jingbaili’

表5 不同激素处理的‘京白梨’外植体组培苗30 d生长特征Tab.5 Growth characteristics of‘Jingbaili’explants treated with different hormone treatments for 30 days

2.5.2 激素处理浓度对组培苗生根的影响

组培苗生根试验主要是通过NAA、IAA、IBA不同生长激素的浓度处理，以及使用不同类型的MS（MS、1/2 MS、1/4 MS）接种。

S3、S5、S7、S9生根培养基中，在15 d观察期内，发现组培苗基部有根原基形成，但在此期间未诱导形成根。其中1/4 MS培养的‘京白梨’组培苗叶片在生长过程中出现发黄的现象。

45 d观察后（图2），S10、S11培养基中的‘京白梨’组培苗成功诱导生根，NAA激素浓度控制在0.5～1范围内都可以促进根系生成，但形成的根系较脆，移栽时容易断裂。

图2 ‘京白梨’组培苗诱导生根生长情况 （45 d后）Fig.2 Rooting growth of'Jingbaili'tissue culture seedlings（45 days later）

3 讨论

植物不同部位器官发育程度、遗传因素等生理状况存在一定差异性，因此，不同器官组织的外植体增殖系数存在一定差异性，多则可分化5～6个芽，少则分化1～2个芽，甚至无增殖现象。适宜外植体的选择对离体组织培养成功至关重要，王萍等[5]以马铃薯的幼叶、茎段、微型和种薯的块茎为外植体进行诱导愈伤组织和植株再生试验，结果表明马铃薯的分化率在不同外植体间差异较大。本研究发现，选用‘京白梨’优良植株老枝条为外植体进行接种污染率显著高于嫩梢，因此在外植体的选择上应尽量采用‘京白梨’植株幼嫩组织，如花芽或刚萌发的嫩梢。植物不同外植体分化成芽体的时间也存在较大差异，陈桂敏等[6]利用蝴蝶兰的茎尖、根尖、叶片、花、花梗等外植体进行组培繁殖，发现不同外植体的增殖速度和增殖系数各有差异，其中花梗诱导花梗腋芽效果最佳，其它部位不能诱导原球茎。本研究发现，‘京白梨’优良植株花芽愈伤组织分化成芽体的时间与嫩梢相比较晚，且不同器官的外植体增殖部位有差异性，有的从侧芽增殖，有的从基部愈伤组织增殖。

筛选合适的培养基对植物组织培养具有重要意义。不同的培养基对外植体愈伤组织的诱导情况是有所差别的，如MS培养基容易诱导出愈伤组织，而B5培养基只能够形成芽点和根。高疆生等[7]对1/2 MS、MS等几种培养基的梨外植体芽增殖率作了比较，发现MS培养基增殖率为15%～25%，1/2 MS培养基为70%。本试验结果表明采用1/2 MS培养基有利于‘京白梨’花芽愈伤组织的形成，但MS培养基有利于组培苗后期生长，原因可能是前期的愈伤组织对MS大量元素要求不高，但后期组培苗的生长需求MS量加大，以支撑苗株后期生长。

外源激素作为植物主要的生长调节剂，对组培苗的诱导分化、增殖和生根起到关键性的作用。在梨的组培试验中，愈伤组织的形成、芽的分化、增殖系数与外源激素的种类、浓度及各激素间的配比有很大关系[8]。本试验中，发现1.5 mg/L浓度GA3可能对组培苗的生长有一定影响，低浓度的生长调节剂NAA能促进茎干的分支。本试验中6-BA、NAA、GA3不同配比对梨的增殖效果明显，结果表明在6-BA浓度不变的条件下，降低NAA浓度、提高GA3浓度或提高NAA浓度、降低GA3浓度均能促进梨组培苗的增殖。外源激素梯度处理可在今后试验中继续优化，增加其它几种激素的处理，如TDZ等，进一步观察这些激素在不同水平下对组培苗生长的影响。

梨属于难生根植物，只有极少数品种生根容易，绝大部分梨品种生根较难[9]。‘京白梨’诱导生根试验中，S10、S11培养基中的‘京白梨’组培苗成功诱导出根系，证明在0.5～1 mg/L浓度范围内的NAA适合‘京白梨’组培苗根系生长。‘京白梨’组培苗生根培养基S1～S9目前只能形成根原基，尚未成功诱导成根，梨组培苗生根条件比较复杂，与温度、光照、激素水平、碳源等外界条件有关。

本研究构建‘京白梨’优良单株组织培养高效快繁体系，通过研究不同外植体、消毒方式，以及不同激素处理对组培增殖生根的影响，为‘京白梨’的离体培养提供理论基础和科学依据。近阶段，随着基因工程和生物技术的广泛应用，梨的离体培养在基因工程育种中应用逐渐增多[10-14]。梨组培过程中不易生根，很难在生产实践中应用，且不同品种间的梨树基因型的差异性[15-17]增大了梨树离体培养体系构建的难度。因此，在今后的探索研究中，不断改进组培技术，减少试验成本，解决组培实际存在的问题将是今后努力发展的方向。

4 结论

选取水培枝条8～15 d后萌发的新嫩梢和茎尖作为外植体进行接种试验，可有效减少污染率，提高‘京白梨’组培苗脱毒繁育成功率；‘京白梨’花芽愈伤组织在1.5 mg/L浓度赤霉素中生长良好，分化个数较多；采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3培养基对‘京白梨’组培苗愈伤组织形成、不定芽生长个数、增殖率、芽长度、叶片生长情况均有良好的促进作用，其中T10培养基更有利于新生枝干的萌发；在生根培养过程中，S10、S11培养基中的‘京白梨’组培苗在45 d后成功诱导生根。因此，‘京白梨’优良单株组织培养快速繁育可以通过以植株幼嫩组织作为外植体、以2%的次氯酸钠作为消毒剂、采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3作为增殖培养基、S10和S11作为生根培养基等来实现。