超声波辅助提取多穗柯棕色素工艺优化

王 坤，李宝财，黄晓露，陈金艳，梁文汇，李开祥

（广西壮族自治区林业科学研究院广西特色经济林培育与利用重点实验室，南宁 530002）

许多合成色素被证明对人体有害，它们的使用已逐渐受到限制，充分利用资源丰富的天然食用色素已是大势所趋[1]。目前，我国已把开发天然食用色素作为发展食品添加剂的一个重要方向。来源于动植物的天然色素，不仅安全性高，很多天然色素还具有较高的营养价值和药理作用[2-4]，所以对天然色素的研究和应用具有广阔的前景和发展潜力。超声波是一种能产生强大能量且穿透力强的弹性波[5-6]，在溶剂提取中可在短时间内穿透植物细胞，在细胞内产生环流，从而提高有效活性成分的扩散和提取[7-8]，超声波在溶剂中产生的强烈振动及空化效应可提高提取效率，有效缩短提取时间，使提取更为完全[9-10]。超声波辅助提取方法具有很好的提取优势，已被广泛应用于植物有效成分的提取[11-14]。

多穗柯（Lithocarpus ploystachyus），又名甜茶[15]，系壳斗科（Fagaceae）栎属常绿乔木。以野生状态分布于我国长江以南各省，资源非常丰富[16]。多穗柯作为一种药食同源性植物，其含有丰富的黄酮类成分且具有很好的药理作用[17-21]，而且其棕色素的含量很高，多穗柯棕色素着色能力强，溶解性很大，有较大的pH值适用范围，对光、热具有较高的稳定性，无毒副作用，是一种很好的天然食用色素资源[22-23]，因此，其具有很高的利用价值，为食品工艺提供一种价廉物美的棕色素天然资源。

目前，对于多穗柯棕色素的研究较少，且利用响应面法优化超声波辅助提取多穗柯棕色素的研究未见报道。本试验以多穗柯叶为原料，用超声波辅助法提取多穗柯棕色素，研究提取剂NaOH溶液的浓度、提取温度、提取时间及液固比等因素对多穗柯棕色素提取的影响，并通过响应面法优化了多穗柯棕色素的最佳工艺条件，以期为多穗柯棕色素的综合利用以及多穗柯棕色素的产业化生产提供一个科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

多穗柯新鲜叶：2014年10月份采摘于广西南宁广西林科院试验基地。无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸均为分析纯，水为超纯水。

LAI-2200可见紫外分光光度计，LI-COR公司；TGL-18M高速低温离心机，上海卢湘仪器有限公司；福玛DGX-9053BC-1电热恒温鼓风干燥箱，上海沪粤明科学仪器有限公司；CPA2245S电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；KQ-250DB超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；JP-400B电脑版中药粉碎机，永康市久品工贸有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

将多穗柯新鲜叶置于40℃的烘箱中干燥、粉碎机粉碎，分别用60孔（边长0.250 mm）和120孔（边长0.125 mm）检验筛进行筛选，取检验筛中间部分为待测多穗柯叶样品，置于-4°C的冰箱中保存。

1.2.2 工艺流程

准确的称取多穗柯样品若干份，每份0.25 g，分别在不同的影响因素下进行超声辅助浸提，超声频率为40 kHz，然后6 000 r/min离心10 min，取滤液。重复操作3次，合并滤液，定容至50 mL容量瓶中，稀释20倍后，利用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描[24-25]，在410 nm处测定其吸光度值[23]。

1.2.3 色素提取剂的选择

分别称取0.25 g待测多穗柯样品，按照料液比1∶20分别加入95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、2.0%NaOH、1.5%NaOH、1.0%NaOH、0.5%NaOH、蒸馏水、1%HCl等不同的提取剂，40℃下超声提取30 min，然后5 000 r/min离心10 min，取滤液。重复超声提取3次，合并滤液，定容至50 mL容量瓶中备用。

取上述不同棕色素提取液稀释20倍后，在紫外分光光度计上于410 nm处测定吸光度，进行比较。

1.2.4 单因素试验

（1）NaOH溶液的浓度对多穗柯棕色素含量的影响。在提取温度50℃，提取时间2 h，液固比40∶1的条件下，将NaOH水溶液的浓度分别设定为0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，其余操作参照试验1.2.2。

（2）提取温度对多穗柯棕色素含量的影响。在NaOH水溶液的浓度为1.0%，提取时间2 h，液固比40∶1的条件下，将提取温度分别设定为30、40、50、60、70℃；其余操作参照试验1.2.2。

（3）提取时间对多穗柯棕色素含量的影响。在NaOH水溶液的浓度为1.0%，提取温度为50℃，液固比40∶1的条件下，将提取时间分别设定为0.5、1、1.5、2、2.5、3 h；其余操作参照试验1.2.2。

（4）液固比对对多穗柯棕色素含量的影响。在NaOH水溶液的浓度为1.0%，提取温度为50℃，提取时间为2 h的条件下，将液固比分别设定为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1；其余操作参照试验1.2.2。

1.2.5 多穗柯棕色素提取的响应面试验

依据单因素试验结果，采用Box-Behnken试验设计设计3因素3水平的响应面分析试验。以多穗柯棕色素提取液吸光度值为响应值，以碱液浓度（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、液固比（D）为中心点进行相应面分析。数据处理采用design expert 8.0.4软件。

1.2.6 统计学分析

使用SAS软件对数据进行统计学分析，每组试验均重复3次，试验数据为平均值。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

多穗柯棕色素在NaOH水溶液中有较好的提取效果（表1），但是浓度还不确定，所以通过单因素试验研究不同碱液浓度对多穗柯棕色素提取的影响。

表1 不同提取溶剂的提取效果Ta.1 Extractive effect of different extracts

2.2 超声波提取单因素最佳条件的确定

2.2.1 NaOH溶液的浓度对多穗柯棕色素含量的影响

随着提取溶剂浓度的增加，多穗柯棕色素的提取得率随之升高（图1）。当提取溶剂浓度在0.1%～0.5%时，棕色素的提取得率直线升高；随后随着提取溶剂浓度增加，棕色素的得率趋于平缓；当NaOH水溶液的浓度为1.0%时，多穗柯棕色素的得率最高，吸光度值为0.613；当NaOH溶液的浓度超过1.0%时，吸光度值维持在一个较稳定的状态。

2.2.2 提取温度对多穗柯棕色素含量的影响

多穗柯棕色素的提取得率随着温度的升高而增加，当达到一定温度时，温度越高，棕色素得率反而有所下降（图2）。当提取温度为50℃时，多穗柯棕色素提取得率最高，提取液的吸光度值为0.623；当温度超过60℃时，多穗柯棕色素的提取得率趋于稳定状态。

图1 不同NaOH浓度对多穗柯棕色素提取液吸光度的影响Fig.1 Effect of NaOH concentration on absorbance of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

图2 不同提取温度对多穗柯棕色素提取液吸光度的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on absorbance of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

2.2.3 提取时间对多穗柯棕色素含量的影响

随着提取时间的增加，多穗柯棕色素的得率随之升高，与时间成比例增加（图3）。当提取时间超过1.5 h后，提取得率升高趋于平缓；当提取时间为2 h时，多穗柯棕色素提取得率最高，提取液的吸光度值为0.600，随后随着提取时间的增加，吸光度值反而缓慢下降。

图3 不同提取时间对多穗柯棕色素提取液吸光度的影响Fig.3 Effect of extraction time on absorbance of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

2.2.4 液固比对多穗柯棕色素含量的影响

当液固比例由10∶1增加到20∶1时，多穗柯棕色素的得率呈直线上升；液固比由20∶1增加到30∶1时，多穗柯棕色素得率缓慢升高；液固比由30∶1增加到80∶1时，棕色素的得率先呈比例升高，后缓慢下降，趋于平缓（图4）。液固比为60∶1时，多穗柯棕色素提取得率最高，提取液的吸光度值为0.703。

图4 液固比对多穗柯棕色素提取液吸光度的影响Fig.4 Effect of liquid to solid ratio on absorbance of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

2.3 超声波法提取多穗柯棕色素的响应面试验

2.3.1 数学模型的建立与检验

根据单因素试验结果，选取对多穗柯棕色素提取影响较为显著的NaOH水溶液的浓度（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、液固比（D）等4个因素，利用design expert软件根据Box-Behnken设计原则设计试验，选取碱液浓度、提取温度、提取时间、及液固比进行试验因素与水平的设计（表2）。

表2 多穗柯棕色素提取的试验因素与水平设定Tab.2 Experimental factor and level design of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

按照相应面设计的因素和水平表，以A、B、C、D为自变量，以吸光度值为响应值（y），试验方案及结果见表3。

表3 多穗柯棕色素提取的Box-Behnken试验设计与结果Tab.3 Testing program and results of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

根据表3中所得数据进行二次多元回归分析，得到响应变量（碱液浓度A、提取温度B、提取时间C、及液固比D）与响应值（吸光度值y）之间的多元二次回归方程。

y=0.73-0.024A+0.066B-0.0035C-0.081D-0.0015AB+0.02AC+0.037AD-0.028BC+0.042BD+0.06CD-0.069A2-0.025B2-0.092C2-0.072D2

对二次多元回归方程各项进行方差分析（表4）。该回归模型极显著（P＜0.01）。回归模型的决定系数为R2=0.943 0，失拟项P=0.112 7＞0.05，失拟性检验结果不显著。说明该模型与数据拟合程度较高，实验误差小，可以用该模型分析和预测超声法提取多穗柯棕色素的结果。此模型预测了碱液浓度A、提取温度B、提取时间C、及液固比D对多穗柯棕色素提取液吸光度值的影响，A、B、D、AD、BD、CD、A2、C2、D2为显著影响因素，其中影响最大的因素是提取温度和液固比，其次是碱液浓度，影响最小的是提取时间。

表4 多穗柯棕色素提取的回归模型方差分析Tab.4 Analysis of variance for fitted regression model of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

2.3.2 多穗柯棕色素提取的响应面分析

为考察各个因素交互作用对吸光度的影响，在其他因素条件不变的情况下，分析交互作用对超声波辅助提取多穗柯棕色素效果的影响作用。

在试验设定的各因素水平范围内，随着各个因素取值的增大，响应面对应值也增大；当响应面值增大到极值后，随着各个因素取值的增大，响应值逐渐减小（图5）。比较各因素交互作用对吸光度值影响的响应面图可知，提取温度和液固比对多穗柯棕色素的提取影响最为显著，表现为曲线陡峭，随其取值的变化，响应值变化较大；其次是碱液浓度，而超声提取时间对提取多穗柯棕色素的影响表现为曲线较平滑，随着取值的变化，响应值变化较小。在交互项中，对吸光度值的影响中，提取时间和液固比的交互作用对多穗柯棕色素的提取效果影响最为显著。

由Design Expert软件得到超声波辅助提取多穗柯棕色素的最佳提取条件：NaOH水溶液的浓度为0.81%，提取温度为60℃，提取时间为1.81 h，液固比为54.67∶1，在此条件下多穗柯棕色素提取液的理论吸光度值为0.798。

2.4 验证试验

为验证模型的有效性，按照选择的最佳工艺进行验证试验，比较试验值与预测值得吻合度。考虑到实际操作的情况，将最佳工艺条件修正：多穗柯待测样品与浓度为0.8%的NaOH溶液按照55∶1的液固比混合，于60℃的温度下超声提取1.8 h。在此条件下，进行3次平行试验，得到多穗柯棕色素提取液的平均吸光度值为0.792，与理论预测值的误差仅为0.4%。然后按下面条件进行试验：NaOH水溶液的浓度为2.0%，提取温度为80℃，提取时间为3 h，液固比为80∶1，吸光度值为0.784。说明采用响应面法得到的优化结果可靠。

图5 各因素交互作用对吸光度值影响的响应面Fig.5 Response surface of effects of various factors on absorbance values

3 结论与讨论

多穗柯作为药食同源性植物，其棕色素的含量很高，是一种很好的天然食用色素资源。上世纪80年代廖代福等[26]采用碱提酸沉法提取分离并且纯化得到多穗柯棕精制品，并对得到的多穗柯棕的理化性质进行分析，发现其具有耐热性、着色力强并且适用于中性及碱性环境中，经毒性试验证明其食用安全性高。90年代廖晓峰等[23]对多穗柯提取食用棕色素进行了工艺研究，并对其理化性质和安全性进行了评价，本研究仅对水浸提法和萃取法进行了初步比较，未对其工艺进行优化研究。本试验利用响应面法对超声波提取多穗柯棕色素的工艺进行了优化，建立的二次多项式数学模型具有显著性，拟合度良好。得到超声波辅助提取多穗柯棕色素的最佳工艺条件：多穗柯待测样品与浓度为0.8%的NaOH溶液按照55∶1的液固比混合，于60℃的温度下超声提取1.8 h，提取次数2次，在此条件下测得多穗柯棕色素提取液的吸光度值为0.792，与理论预测值的误差为0.4%，用该数学模型预测超声波辅助提取多穗柯棕色素可行可靠。采用响应面法优化多穗柯棕色素提取工艺条件对多穗柯棕色素的综合利用以及多穗柯棕色素的产业化具有理论指导意义。