Notch信号通路调控CD4+T细胞分泌IL－22在Vogt－小柳原田综合征中的作用

储昭节，王 彤，马 强，范晶晶，蔡 敏

作者单位:(710002)中国陕西省西安市第一医院眼科西安市眼科医院陕西省眼科研究所

0 引言

Vogt－小柳原田(Vogt－Koyanagi－Harada syndrome，VKH)综合征是一种由自身免疫反应引发的攻击黑色素细胞抗原导致的致盲性眼病，以双侧肉芽肿性全葡萄膜炎为主要特征，还可侵袭耳、脑脊髓膜、毛发、皮肤等器官［1］。VKH综合征的发病机制尚未完全阐明，病毒感染、自身免疫等因素均参与了VKH的发病。白细胞介素(interleukin，IL)－22属于 IL－10细胞因子家族成员，主要由CD4+T细胞分泌，IL－22的受体仅表达在组织器官的实质细胞中，因此IL－22介导的信号通路主要参与组织器官炎症应答的调控，在肿瘤、感染和自身免疫性疾病中均发挥重要的调控作用［2－3］。IL－22的表达受多种因素的调控，研究发现Notch信号通路可通过诱导芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)表达调控CD4+T细胞分泌 IL－22，诱导肝脏炎症应答［4－6］。但有关 IL－22 在VKH综合征患者中的表达及其调控机制尚未见相关报道。因此，本研究观察了Notch受体和IL－22在VKH综合征患者中的表达，并评估VKH患者中Notch信号通路对CD4+T细胞分泌IL－22的调控作用，以期初步阐释VKH综合征的免疫发病机制。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016－09/2018－06本院就诊的VKH综合征患者35例，其中活动期15例，男8例，女7例，年龄29～55(平均39.0±11.9)岁，活动期患者采集标本时未接受任何药物治疗;静止期20例，男10例，女10例，年龄31～54(平均39.2±12.1)岁，静止期患者使用免疫抑制剂治疗1a以上，炎症静止3mo以上。纳入标准:(1)年龄18～65岁;(2)符合国际命名委员会的标准以及杨培增教授提出的参考标准［1，7］;(3)获得知情同意。排除标准:(1)合并慢性病毒感染;(2)合并其他自身免疫性疾病;(3)合并恶性肿瘤;(4)合并心、脑、肺、肝脏等重要脏器功能障碍;(5)妊娠期或哺乳期妇女。选取同时期在我院进行体检的12例志愿者作为健康对照者，男7例，女5例，年龄28～55(平均37.1±10.8)岁，健康对照的年龄和性别比例与VKH综合征患者的差异无统计学意义(P＞0.05)。本研究方案已经在本院伦理委员会备案并获得批准，所有研究对象均对本研究了解并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血浆和CD4+T细胞的分选 清晨、空腹采集研究对象EDTA抗凝外周血10mL，3 000g/min离心10min，收集上层血浆，冻存于－80℃备用。下层血细胞使用Ficoll淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)、采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，使用CD4+细胞分选试剂盒(德国美天旎公司)按说明书要求分选外周血单个核细胞中的CD4+T细胞。

1.2.2 CD4+T细胞的刺激 培养取106个分选的CD4+T细胞，加入抗CD3/CD28抗体(终浓度1μg/mL)，同时加入Notch信号通路抑制剂DAPT(美国Selleck公司，终浓度75μmol/L)刺激培养48h后收集培养细胞和上清。

1.2.3 实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR) 使用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA，取1μg总RNA，使用反转录试剂盒(瑞士罗氏公司)将总 RNA反转录为 cDNA，使用FastStart DNA Master SYBR Green I实时定量PCR试剂盒(瑞士罗氏公司)对目的片段进行扩增，引物序列根据既往文献［5，8］合成。采用50μL反应体系，反应条件:预变性:94℃ 5min;PCR 反应 94℃ 10s，50℃ 20s，72℃ 30s，共35个循环。应用2－ΔΔCt法对目的片段的相对表达量进行分析。

1.2.4 Western blot 取 5×105个 CD4+T细胞，加入250μL 2×SDS 缓冲液+5μL β－巯基乙醇裂解细胞，孵育5min后于95℃静置10min，离心后将待测样本加入SDSPAGE电泳浓缩胶孔中，100V将蛋白分离后电转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的PBS－T封闭1h，洗涤后分别加入抗Notch1抗体(1∶500稀释)、抗 Notch2抗体(1∶200稀释)、抗 Notch3抗体(1∶400 稀释)、抗 Notch4 抗体(1∶700稀释)、抗 Hes－1抗体(1∶1000稀释)、抗 Hes－5抗体(1∶1000稀释)或抗GAPDH 抗体(1∶2000稀释)(所有抗体均购自美国Abcam公司)，4℃孵育过夜。洗涤后加入抗兔或抗小鼠IgG－HRP(1∶2000稀释)，室温孵育2h。洗涤后利用化学发光法成像。

1.2.5 酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA) 使用商品化人 IL－22 ELISA检测试剂盒(美国R＆D公司)对血浆和培养上清中IL－22表达水平进行检测，操作严格按说明书要求进行。

1.2.6 流式细胞术 分选的CD4+T细胞使用佛波酯(终浓度50ng/mL)和伊乌诺霉素(终浓度1μg/mL)刺激培养12h，同时加入莫能霉素(终浓度10μg/mL)抑制蛋白转运。收集细胞转入FACS管中，加入抗CD4－APC(美国BD公司)进行表面染色，4℃避光孵育20min，洗涤后加入破膜固定液孵育30min，然后加入抗IL－17－FITC(美国BD公司)和抗IL－22－PerCP(美国BD公司)进行细胞内细胞因子染色，室温避光孵育30min，洗涤后加入含有4%多聚甲醛/PBS溶液固定，使用FACS Calibur流式细胞仪分析，CellQuest Pro软件获取细胞，FlowJo Version 8.4.2软件分析结果。

统计学分析:所有数据均采用SPSS 21.0软件进行统计分析。首先采用Shapiro－Wilk检验对样本的正态性进行分析，所有样本均符合正态分布。计量资料采用珋x±s表示，多组样本间资料比较首先采用单因素方差分析，若存在差异再采用LSD－t检验进行两两比较，DAPT刺激前后的资料比较采用配对样本t检验，采用Pearson相关性分析对两组资料进行相关性检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 VKH综合征患者CD4+T细胞中Notch受体mRNA相对表达量和蛋白表达的变化 健康对照、静止期VKH综合征和活动期VKH综合征患者间CD4+T细胞中Notch1 mRNA(F=238.8，P＜0.001)、Notch2 mRNA(F=183.7，P＜0.001)和 Notch3 mRNA(F=130.9，P＜0.001)的差异具有统计学意义。活动期VKH综合征患者CD4+T细胞中Notch1、Notch2和Notch3 mRNA相对表达量较静止期VKH综合征患者和健康对照均显著升高(均P＜0.001)，但在静止期VKH综合征患者和健康对照之间的差异无统计学意义(P=0.313、0.162、0.376)。CD4+T细胞中Notch4 mRNA相对表达量在三组之间的差异无统计学意义(F=0.362，P=0.698)，见图 1。

图1 实时定量PCR检测健康对照和VKH综合征患者Notch受体mRNA的表达 A:Notch1;B:Notch2;C:Notch3;D:Notch4;bP＜0.001 vs健康对照和静止期VKH。

进一步检测了 Notch1、Notch2、Notch3和 Notch4蛋白在6例活动性VKH综合征患者和5例健康对照志愿者CD4+T细胞中的水平。与mRNA相对表达量的趋势相似，VKH综合征患者 CD4+T细胞中 Notch1、Notch2和Notch3蛋白水平显著高于健康对照，而Notch4蛋白水平在两组之间无显著差异(图2)。

2.2 VKH综合征患者血浆IL－22、CD4+T细胞中AhR和RORγt转录因子以及Th17、Th22细胞的变化 血浆IL－22在健康对照、静止期VKH综合征和活动期VKH综合征患者之间的差异有统计学意义(F=101.6，P＜0.001，图3)。活动期 VKH综合征患者血浆 IL－22(304.2±59.23pg/mL)显著高于静止期VKH综合征患者(133.4±19.89pg/mL)和健康对照(140.2±23.47pg/mL)，差异均有统计学意义(均P＜0.001)，但在静止期VKH综合征患者和健康对照之间的差异无统计学意义(P=0.388)，且血浆IL－22水平与Notch受体mRNA相对表达量无显著相关(P＞0.05)。健康对照、静止期VKH综合征和活动期VKH综合征患者间CD4+T细胞中Th22细胞转录因子AhR mRNA(F=224.2，P＜0.001)和 Th17细胞转录因子RORγt mRNA(F=99.12，P＜0.001)的差异具有统计学意义，见图4。活动期VKH综合征患者CD4+T细胞中AhR和RORγt mRNA相对表达量较静止期VKH综合征患者和健康对照均显著升高(均P＜0.001)，但在静止期VKH综合征患者和健康对照之间的差异无统计学意义(P=0.234、0.242)。Th22细胞和Th17细胞的流式检测分析见图5。健康对照、静止期VKH综合征和活动期VKH综合征患者Th22细胞(F=18.76，P＜0.001)和Th17细胞(F=22.04，P＜0.001)比例的差异具有统计学意义。活动期VKH综合征患者CD4+T细胞中Th22(3.38%±0.78%)和Th17细胞(5.51%±1.14%)比例较静止期VKH综合征患者(Th22:2.03%±0.63%;Th17:3.73%±0.86%)和健康对照(Th22:1.94%±0.81%;Th17:3.38%±0.72%)均显著升高(均P＜0.001)，但在静止期VKH综合征患者和健康对照之间的差异无统计学意义(P=0.725、0.236)。

图2 Western blot检测健康对照和活性期VKH综合征患者Notch受体蛋白的表达。

2.3 抑制Notch信号通路对活动性VKH综合征患者CD4+T细胞转录因子表达和分泌IL－22的影响 取106个从活动性VKH综合征患者分选的CD4+T细胞，加入DAPT刺激后，Notch信号通路下游分子Hes1和Hes5的表达显著降低(图6A)，提示DAPT有效抑制了Notch信号通路。AhR mRNA相对表达量显著降低(t=7.088，P＜0.001，图6B)，但RORγt mRNA相对表达量在无DAPT刺激和DAPT刺激的CD4+T细胞中的差异无统计学意义(t=1.247，P=0.233，图 6C)。DAPT刺激后 CD4+T细胞分泌IL－22的水平亦显著降低(44.47±11.83pg/mL vs 78.87±9.63pg/mL;t=8.472，P＜0.001，图 6D)。

3 讨论

虽然VKH综合征的发病机制尚未完全阐明，目前的研究均认为VKH综合征是机体攻击靶器官中的黑色素相关抗原所致的自身免疫性疾病。研究发现，VKH综合征的发病与人类白细胞抗原等位基因的多态性、IL－23受体的表达、固有免疫和适应性免疫功能失调以及环境诱导的免疫失衡等多种免疫因素相关［9－11］。

图3 ELISA检测健康对照和VKH综合征患者血浆IL－22的表达 bP＜0.001 vs健康对照和静止期VKH。

图5 流式细胞术检测健康对照和VKH综合征患者Th22和Th17细胞比例 A:流式检测散点图;B:Th22;C:Th17;bP＜0.001 vs健康对照和静止期VKH。

Notch信号通路是一种高度保守的细胞信号通路，可影响细胞形态和功能发育的多个过程，如多能祖细胞的分化、细胞增殖和凋亡等［12］。Notch信号通路在眼部血管系统发育中发挥重要作用，参与多种与血管生成相关的眼病(如视网膜新生血管疾病、脉络膜新生血管疾病)的发生发展［13］。新近的研究发现，Notch1信号通路在氧诱导的视网膜血管退化中亦发挥调控作用［14］。但目前尚无Notch信号通路在VKH综合征发病中的相关研究报道。本研究发现，Notch1、Notch2和Notch3 mRNA和蛋白在活动性VKH综合征CD4+T细胞中的表达显著升高，但在静止期VKH综合征患者中的表达则无明显变化，提示Notch信号通路不但参与了VKH综合征疾病的炎症活动，还说明抑制机体免疫应答可能降低了Notch受体的表达。虽然仅有Notch1、Notch2和Notch3的表达升高，Notch4的表达无显著变化，而根据实时定量PCR和Western blot结果，提示Notch2受体占优势。但Notch1～4介导的下游信号通路是相同的，因此Notch1、Notch2和Notch3的表达升高已足够诱导下游信号分子的活化。但由于Notch信号通路具有重要且广泛的免疫应答调控功能，其在VKH综合征发生发展中的免疫调控机制尚待深入研究。

图6 DAPT刺激对活动性VKH综合征患者CD4+T细胞中Notch下游信号分子表达和AhR、RORγt mRNA及分泌IL－22的影响A:Hes1和Hes5蛋白表达;B:AhR mRNA;C:RORγt mRNA;D:IL－22分泌;bP＜0.001 vs无DAPT刺激。

IL－22是一种具有双重功能的细胞因子，其发挥促进炎症应答或发挥免疫保护的功能取决于疾病类型、病期以及 IL－22 所处的免疫微环境等［15］。在活动性巩膜炎［16］、自身免疫性非感染性葡萄膜炎［17］、干眼症［18］患者的外周血或泪液中，IL－22的表达水平显著升高;但在增生性糖尿病视网膜病变患者的房水中，IL－22的水平却未见明显变化［19］。但尚未见有关IL－22在VKH综合征患者中的相关报道。本研究发现，活动期VKH综合征患者血浆IL－22、Th17和Th22细胞的水平显著升高，但静止期VKH综合征患者IL－22、Th17和Th22细胞的水平与健康对照比较则无明显变化，提示IL－22不但参与了VKH综合征患者的机体炎症应答。还说明抑制机体免疫应答可能降低了IL－22的分泌。CD4+T细胞分泌IL－22主要由Notch信号通路调控，Th22细胞转录因子AhR参与了此过程，Notch－AhR－IL－22信号通路具有精细调控炎症应答作用［4］。因此，虽然本研究在活动性VKH综合征患者中未发现Notch受体与 IL－22表达存在明显相关，但应用DAPT抑制Notch信号通路却显著降低IL－22的表达，在此过程中，Th22细胞转录因子AhR表达降低，而Th17细胞转录因子RORγt的表达未受明显影响，提示Notch信号通路可能主要影响Th22细胞分泌IL－22，而对Th17细胞分泌IL－22的功能无显著影响，这与在慢性病毒性肝炎［5－6］、肺癌［20］中的研究结果一致。由于既往的研究发现，IL－23受体和Th17细胞在VKH综合征中的水平均升高，促进了 VKH 综合征的疾病进展［11，21］。IL－23 主要作用于Th17细胞，促进Th17细胞产生IL－17和IL－22等细胞因子。因此，作为Th17细胞分泌的另外一种重要细胞因子，IL－22在VKH综合征中很可能发挥促进炎症应答、诱导疾病进展的作用，而这一功能仍有待体内试验进一步证实。

总之，Notch－AhR－IL－22信号通路可调控VKH综合征的炎症应答，参与了VKH综合征的发病，促进VKH综合征的疾病进展。Notch信号通路及IL－22的调控可能作为治疗靶点，为VKH综合征的治疗提供新的思路。