慢性阻塞性肺疾病大鼠IL-10、TNF-α及INF-γ检测意义及与气道阻力的相关性分析*

汪新龙 刘朝晖 丁巍 梁志科

（广东省广州市第一人民医院急诊科 广州510180）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是以持续气流受限为特征的气道慢性异常炎症反应性疾病[1]。可引起肺外各器官组织损害，在COPD的自然病程中，多种炎症因子参与其中[2]。白介素10（Interleukin10,IL-10）为具有抑制炎症反应的细胞因子，在炎症反应中起重要作用[3]。肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）为一种多功能细胞因子，具有广泛生物活性，是机体发生炎症反应的重要介质，也是目前反应机体炎症及组织损伤的敏感指标。干扰素-γ（INF-γ）为Th-1细胞分泌的一种特征性细胞因子，可诱导上皮细胞、单核细胞产生白介素等炎症因子，破坏生理防御及免疫监测平衡，继而诱导炎症反应。本研究旨在分析慢性阻塞性肺疾病大鼠血清和肺组织中IL-10、TNF-α、INF-γ检测意义及与气道阻力的相关性。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 模型建立 选取自广东省医学动物实验中心购买雄性大鼠45只，周龄均为8周，平均体质量为（221.95±6.45）g。采用随机数字表法分为模型组30只，对照组15只。模型建立于试验第1天及第15天，两组均予以10%水合氯醛（国药准字H37022673）4 ml腹腔注射，模型组缓慢向气道内注射脂多糖 （LPS，美国Sigma公司生产，货号：L2880）0.2 ml，每日 10:00和 15:00予以烟熏 30 min，持续4周；对照组缓慢注射生理盐水0.2 ml，然后放入饲养笼，正常进食和进水，不予以烟熏处理。

1.2 大鼠肺功能及炎症因子等指标的检测 气道阻力及肺顺应性检测采用美国Buxco公司生产的Buxco动物肺功能RC系统，尾尖取静脉血0.5 ml留置真空抗凝管，4℃低温离心10 min，3 500 r/min，取上清液用于检测。两组大鼠肺组织放入10%福尔马林溶液中浸泡24 h，然后沿右肺门横断进行病理组织取材，采用石蜡包埋，二甲苯对组织标本进行脱蜡处理后先后采用乙醇和水进行冲洗，冲洗完成后苏木精染色处理，1%盐酸-乙醇分化液处理，然后伊红染色，常规脱水，中性树胶凝封，加PBS溶液，充分匀浆后制成匀浆液，充分离心后取上层清液。采用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测IL-10、TNF-α及INF-γ水平。

1.3 统计学方法 数据处理采用SPSS13.0统计学软件，计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料用率表示，进行χ2检验，同时进行相关性，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 观察两组肺组织形态学 （1）COPD模型组：肺组织颜色苍白，体积增大，弹性差；肺组织表面无渗血情况，被膜下存在极个别出血点。镜下观察可见细支气管管壁增厚，呼吸性支气管狭窄或闭塞；纤毛倒伏，部分脱落；支气管黏膜细胞变性、坏死、增生，黏膜下炎症细胞大量浸润，以淋巴细胞、浆细胞为主，部分为中性粒细胞；肺泡壁变薄，肺泡腔增大、破裂，或融合成肺大疱。见图1-A。（2）对照组：肺组织表面光滑，质软、色泽红润，弹性较好，未见渗血，且被膜下无出血。镜下观察未见模型组大鼠类似变化。见图1-B。

图1 大鼠肺组织病理变化（HE×100）

2.2 两组大鼠肺功能及血气指标观察比较 （1）肺功能指标：模型组大鼠较对照组大鼠气道阻力明显升高，而肺顺应性较对照组大鼠显著降低，P＜0.01。（2）动脉血气指标：模型组大鼠pH值、PaO2水平显著低于对照组，PaCO2水平明显高于对照组，P＜0.01。见表1。

表1 两组大鼠肺功能及动脉血气指标比较（±s）

表1 两组大鼠肺功能及动脉血气指标比较（±s）

动脉血气指标p H P a O 2 P a C O 2（m m H g） （m m H g）模型组对照组组别 n肺功能指标气道阻力 肺顺应性[k p a/（m l·s）] （m l/c m H 2 O）3 0 1 5 t P 0.4 8 9±0.0 7 2 0.2 9 5±0.0 4 7 9.4 4 8＜0.0 1 0.3 6 2±0.0 6 1 0.5 2 8±0.0 5 6 8.8 3 5＜0.0 1 7.1 1±0.1 1 7.3 5±0.2 5 4.4 9 5＜0.0 1 6 8.8 4±1 0.1 5 9 5.6 2±7.6 9 8.9 9 0＜0.0 1 6 1.2 5±9.2 6 4 6.6 5±6.0 4 5.5 2 9＜0.0 1

2.3 两组血清、肺组织炎症因子水平比较 模型组血清、肺组织中IL-10水平较对照组明显降低，TNF-α和INF-γ水平显著升高，P＜0.01。见表2。

表2 两组血清、肺组织炎症因子表达比较（ng/L，±s）

表2 两组血清、肺组织炎症因子表达比较（ng/L，±s）

I N F-γ血清 肺组织模型组对照组组别 n I L-1 0血清 肺组织T N F-α血清 肺组织3 0 1 5 t P 4 4.6 9±8.6 7 7 5.9 5±1 0.5 9 1 0.5 8 5＜0.0 1 6 4.5 9±9.0 6 9 4.0 5±8.9 4 1 0.3 2 7＜0.0 1 7 1.9 1±6.4 5 4 5.5 6±5.6 2 1 3.4 1 1＜0.0 1 1 2 4.1 5±1 5.3 2 7 1.4 2±6.9 5 1 2.6 4 1＜0.0 1 9 0 7.1 5±1 4 2.6 2 6 4 5.2 5±2 8.4 5 9.7 8 2＜0.0 1 9 8 3.2 3±1 5 3.6 2 6 7 0.0 5±1 2 5.4 5 7.3 2 2＜0.0 1

2.4 COPD大鼠IL-10、TNF-α和INF-γ水平与肺功能指标相关性分析 COPD大鼠血清IL-10水平与气道阻力呈负相关，r=-0.715，P＜0.01。见图2。肺组织IL-10水平与气道阻力呈负相关，r=-0.792，P＜0.01。见图3。血清TNF-α水平与气道阻力呈正相关，r=0.752，P＜0.01。见图 4。肺组织 TNF-α 水平与气道阻力呈正相关，r=0.749，P＜0.01。见图5。血清INF-γ水平与气道阻力呈正相关，r=0.801，P＜0.01。见图6。肺组织INF-γ水平与气道阻力呈正相关，r=0.835，P＜0.01。见图 7。

图2 COPD大鼠血清IL-10水平与气道阻力相关性分析

图3 COPD大鼠肺组织IL-10水平与气道阻力相关性分析

图4 COPD大鼠血清TNF-α水平与气道阻力相关性分析

图5 COPD大鼠肺组织TNF-α水平与气道阻力相关性分析

图6 COPD大鼠血清INF-γ水平与气道阻力相关性分析

图7 COPD大鼠肺组织INF-γ水平与气道阻力相关性分析

3 讨论

COPD是呼吸系统常见疾病，主要特征是慢性气流受阻，且呈进行性进展。目前有关本病发病机制尚未确切，初步认为是气道受阻、肺实质及肺血管慢性炎症性损伤导致气道及血管壁重塑是本病基本病理特征[4]。近年来，大量研究[5]证实嗜中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞等细胞因子参与本病发病过程中。本实验通过向大鼠气管内注射脂多糖，并反复香薰的方式建模，比传统吸入SO2安全性高，比单纯熏香烟需要的时间更短，研究符合COPD病情变化发展过程。本实验通过对大鼠肺组织观察证实，COPD模型大鼠具备和人类COPD患者类似的气道非特异性炎症及阻塞性通气障碍，且结合生化实验确定COPD大鼠模型建立成功。

TNF-α是多功能细胞因子，具有激活炎症细胞以及增加毒性作用，同时还能释放其他炎症细胞趋化因子，引起气道高反应性[6]。且TNF-α会加重炎症反应，引起呼吸道细胞分裂增殖，促使气道结构重塑及肺组织纤维化[7]。本研究结果显示，模型组血清、肺组织TNF-α水平明显较对照组高，可见TNF-α参与COPD的发病机制及炎症反应过程。INF-γ为调节细胞功能的小分子多肽，主要由CD4+T细胞中Th1细胞产生，主要介导细胞免疫，可调节免疫网络中其他细胞生物活性，对机体免疫反应的启动、表现及免疫反应强弱起重要作用。研究表明[8]，INF-γ可激活血管内皮细胞，促进炎症细胞渗出；INF-γ还可刺激单核巨噬细胞分泌细胞因子，继而激活中性粒细胞，促进炎症介质及炎性蛋白释放，进而参与炎症反应过程。国外研究发现[7]，INF-γ可调节细胞趋化因子表达，诱导MMP-12产生，抑制分泌型蛋白酶抑制剂产生，继而促进COPD气道炎症。本研究结果表明，模型组血清、肺组织INF-γ水平显著较对照组高，血清、肺组织中TNF-α水平及INF-γ水平均与气道阻力呈正相关。可见TNF-α和INF-γ为COPD发病过程中的重要促炎因子，是引起气道受阻的关键之一。

IL-10是一种重要抑炎因子，可对中性粒细胞、肺泡巨噬细胞分泌炎症因子产生抑制作用，尤其是抑制IL-1、IL-6及TNF-α等细胞因子，继而抑制气道炎症反应。有关其抑制炎症因子机制尚不明确，目前初步认为该抑制作用主要发生于mRNA转录和翻译水平，且在吸烟人群及COPD患者痰液中IL-10表达均下降。根据以上数据可以看出，模型组大鼠血清和肺组织中的IL-10水平明显低于对照组，且经相关性分析，IL-10水平与气道阻力呈负相关性。与张晓军等[9]研究结果相似。故初步认为，在COPD自然病程中，IL-10的下调可加重炎症，促使气道重构[10]。

综上所述，TNF-α和INF-γ作为重要的促炎因子，通过其在体内表达情况可间接反应COPD疾病进展情况。IL-10为重要的抗炎因子，在COPD呼吸道炎症反应机制中起保护作用。故临床可通过监测、调控IL-10表达，作为COPD患者气道炎症反应临床防治的新思路。