他莫昔芬治疗乳腺癌异种移植瘤裸鼠子宫病理改变

王月姣 阮祥燕，2* 谷牧青 蔡桂举 李 雪 张凌燕 Alfred O.Mueck，2

(1.首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科，北京 100026;2.德国图宾根大学妇产医院妇女健康部与妇女健康研究中心，图宾根 D-72076，德国)

乳腺癌是中国女性发病率第一的癌症，由于乳腺钼靶的检查和他莫昔芬的使用，乳腺癌的病死率有所下降(位居第五)，但仍是当今社会最重要的影响女性健康的问题之一[1]。他莫昔芬(tamoxifen, TAM)即三苯氧胺，为非甾体类抗雌激素药物，在体内竞争性结合雌激素受体(estrogen receptor, ER)，具有抗雌激素及弱雌激素效果[2]。因此他莫昔芬是激素依赖性转移乳腺癌的首选治疗药物，也是ER(+)的原发乳腺癌的辅助治疗药物[3]。TAM自1960年开始应用于治疗晚期乳腺癌，1985年开始作为辅助治疗广泛应用于各期乳腺癌的治疗，几十年来他莫昔芬一直在乳腺癌内分泌治疗中占据首要地位[4]。癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)研究[5]中指出：乳腺癌患者应用他莫昔芬治疗5年和10年后，出现子宫内膜癌的风险增高，发生率分别为1.6%及3.1%。临床中有研究者[6]发现，经他莫昔芬治疗后，阴道超声可见内膜基质增生及上皮萎缩，产生与增生型内膜、萎缩型内膜、息肉相似的超声影像学，但具体病理改变尚不清楚。

本研究的目的是观察乳腺癌异种移植瘤经他莫昔芬治疗后子宫的病理改变及孕激素治疗是否会影响乳腺癌的增生及他莫昔芬的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 细胞系培养

MCF7细胞系是人类雌激素受体阳性的原发性乳腺癌细胞系，从美国标准培养库(American Type Culture Collection，ATCC)购买 MCF7 乳腺癌细胞系, 将细胞培养于含10%(体积分数)热灭活胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)、25 mmol/L HEPES以及1%(质量分数)青霉素的RPMI-1640 培养液中。37 ℃，5%(体积分数)CO2条件下细胞培养箱中进行培养。

1.2 实验动物

25只6～7周龄的BALB/c雌性裸鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，裸鼠质量18～20 g，动物生产合格证号：SCXK(京)2016-0006，饲养于SPF级动物室。因为裸鼠MCF7异种移植瘤细胞生长需要雌激素的存在，所以雌二醇(estradiol，E2)缓释片在肿瘤细胞注射前48 h植入(可诱导E2浓度为1 000 pg/mL，与绝经期激素治疗产生的约100pg/mL为生物等效剂量)。将各裸鼠皮下注射上述细胞悬液 100 μL/site，注射细胞数为1×107。细胞注射当天记为接种第0天。

1.3 分组及给药

用电子卡尺每周两次测量每个肿瘤的长度和宽度，计算肿瘤体积，计算公式为：体积=1/2×长度×宽度2。43 d后，测量每只裸鼠的肿瘤体积，将25只裸鼠按照肿瘤大小采用数字表法随机分为4个亚组：安慰剂组、黄体酮(progesterone, P)组、他莫昔芬组及黄体酮+他莫昔芬组，每组6只裸鼠(剩余1只裸鼠实施安乐死)。随机分组时亦考虑各组裸鼠体质量，分别使各组间裸鼠平均体质量处于同一水平。安慰剂组：予以0.1 mL的玉米油腹腔注射；P组：黄体酮片(10 mg/片，60 d缓释)皮下包埋；TAM组：电子天平称量他莫昔芬粉末(Tamoxifen，Sigma公司，美国)100 mg，加入到20 mL预温到42 ℃的玉米油(Corn Oil, Sigma公司，美国)，震荡后充分溶解，得到5 mg/mL他莫昔芬溶液，以铝箔纸包裹，4 ℃保存，用前恢复至室温。对裸鼠进行5 mg/mL 他莫昔芬0.1 mL腹腔注射，连续注射3 d，停一天。P+TAM组、进行黄体酮皮下包埋，他莫昔芬腹腔注射剂量同TAM组。每周两次测量裸鼠体质量及肿瘤体积，治疗结束时(56 d)，处死裸鼠取肿瘤、子宫。新鲜的组织立即置于4%(质量分数)多聚甲醛中保存，进行HE染色及肿瘤生长曲线的绘制。

1.5 苏木精-伊红染色及腺体计数

子宫组织用4%(质量分数)多聚甲醛固定过夜，制作石蜡切片，石蜡切片脱蜡至水后，进行苏木精伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色，显微镜镜检，图像分析采集。每张切片随机选取6个视野(80×)，统计其腺体数量，取平均值。

1.6 统计学方法

用SPSS 17.0进行统计学分析。计量数据计算均数、标准差，各组肿瘤生长速度比较采用重复测量数据的方差分析；各组腺体个数比较采用单因素的方差分析，两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠肿瘤生长曲线

治疗第56天，与安慰剂组相比，黄体酮组均未促进肿瘤的额外增生(P=0.424，P=0.686)，与初始值相比，安慰剂组(于第25天，1只裸鼠死亡)与黄体酮组(于第15及31天，各有1只裸鼠死亡)肿瘤体积分别增加了334.14%、331.14%；他莫昔芬治疗后，与安慰剂组相比，肿瘤生长速度呈下降趋势，且差异有统计学意义(P<0.01)。他莫昔芬联合黄体酮组与单独他莫昔芬处理组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，肿瘤体积较初始值分别降低了59.31%、59.51%(图1)。

2.2 HE染色结果

与安慰剂组相比，他莫昔芬治疗后的裸鼠异种移植瘤HE染色可见：肿瘤组织较疏松，肿瘤细胞数量明显减少，可见坏死的肿瘤细胞和中性粒细胞及淋巴细胞浸润(图2)。

图1 MCF7异种移植瘤肿瘤生长Fig.1 Tumor growth curve of MCF7 xenografts in nude mice

A：tumor growth curve；B: representative images of the tumors after treatment at day 56. E2+Placebo groupvsTamoxifen group*P<0.05;**P<0.01;E2:estradiol.

与安慰剂组相比，他莫昔芬处理后的子宫内膜HE染色可见：腺体数量增多，出现背靠背现象；腺上皮细胞层次增多，排列紊乱，腺体细胞核大，且深染，形状不一；腺上皮个别细胞可见异型性(图3)，所有经他莫昔芬及他莫昔芬联合黄体酮处理后的裸鼠子宫HE染色均出现上述改变。

2.3 腺体计数

与安慰剂组相比，单用黄体酮并未促进子宫腺体增加，差异无统计学意义(P>0.05)；经过他莫昔芬治疗后的异种移植瘤裸鼠子宫内膜腺体明显数量增加，且差异均有统计学意义(P<0.01)；他莫昔芬处理组与他莫昔芬联合黄体酮处理组差异无统计学意义(P=0.10)(表1、图4)。

3 讨论

1998年，由牛津大学组织的一项发表于《柳叶刀》杂志的研究[7]提出，他莫昔芬在预防和治疗乳腺癌中都起到了极大的作用，应用他莫昔芬治疗5年后，乳腺癌的复发率明显降低，能提高患者10年生存率，因此广泛应用于乳腺癌的治疗。他莫昔芬作为雌激素类似物，既有弱雌激素效应，也有抗雌激素效应，在乳腺组织中发挥抗雌激素及抗增生作用，一般用于乳腺癌治疗[8]；同时由于他莫昔芬在子宫中发挥类雌激素作用，长期作用于子宫可导致子宫内膜增厚[2]。因此临床上出现他莫昔芬治疗后的女性子宫内膜间质增生、水肿，超声下可见子宫内膜增厚、不均的影像[6]。本研究模拟乳腺癌患者经他莫昔芬治疗后的异种移植瘤模型，发现他莫昔芬与他莫昔芬及黄体酮处理后的子宫腺体明显增加，子宫内膜出现不典型增生病理改变。因孕激素具有拮抗雌激素的作用，可保护子宫内膜，但本研究结果显示，应用天然孕激素黄体酮未改变他莫昔芬对子宫内膜的增生作用。虽然他莫昔芬对乳腺癌的治疗效果良好，但临床用药也应警惕子宫内膜癌发生的风险。

图2 不同组的MCF7裸鼠移植瘤HE染色Fig.2 HE staining of MCF7 xenografts in nude mice

A：E2+Placebo;B:E2+Progesterone;C：E2+Tamoxifen;D：E2+Progesterone+Tamoxifen；Scalebars： 100μm;HE: hematoxylin and eosin;E2:estradiol.

图3 不同处理移植瘤裸鼠子宫内膜HE染色Fig.3 HE staining of endometrium in nude mice in different groups

A：E2+Placebo;B:E2+Progesterone;C：E2+Tamoxifen;D：E2+Progesterone+Tamoxifen.Scalebars: 100μm;HE: hematoxylin and eosin;E2:estradiol.

表1 不同治疗组MCF7异种移植瘤裸鼠子宫腺体数量比较Tab.1 Univariate ANOVA analysis of the number of uterine gland from MCF7 xenografts in nude mice

图4 不同组的裸鼠子宫腺体个数Fig.4 The number of uterine glands in nude mice

A：E2+Placebo;B:E2+Progesterone;C：E2+Tamoxifen;D：E2+Progesterone+Tamoxifen,*P<0.05,**P<0.01;E2:estradiol.

随着女性对更年期的认识不断提高，越来越多的围绝经期女性开始进行激素替代治疗绝经相关症状如更年期综合征、骨质疏松、心脑血管疾病等[9-10]，但乳腺癌风险一直是围绝经期女性激素替代治疗所担忧的重要问题之一。激素治疗中主要的安全问题就是乳腺癌患病风险，绝经后激素治疗与乳腺癌的风险争论一直是绝经后女性及妇科内分泌领域的热点及难点[11-12]。本课题组之前的多项研究[13-14]显示：天然孕酮如黄体酮并未增加乳腺癌组织的增生作用，与笔者本次研究的结果一致。2015年发表于Nature的一篇文章[15]显示：孕激素与他莫昔芬都可以单独对抗雌激素诱导肿瘤的形成，但是他莫昔芬联合孕激素的作用最大。而本研究得出的结论显示，黄体酮并未促进乳腺癌的额外增生，两者的实验结果的差别可能由于裸鼠的样本量及个体差异造成实验结论不同，但两项实验都证实了黄体酮未促进肿瘤的额外增生，同时孕激素治疗后对裸鼠子宫内膜未产生病理改变。对临床绝经女性的激素治疗提供了理论依据。但他莫昔芬治疗后子宫内膜不典型增生、子宫腺体增生活跃的具体机制仍不清楚，需要进一步的探讨研究。

结论：在异种移植瘤裸鼠模型中，他莫昔芬治疗后的异种移植瘤体积明显缩小，治疗效果明显。但他莫昔芬的应用导致裸鼠子宫腺体增加，呈不典型增生的病理改变，提示子宫内膜癌的风险可能增加。应用黄体酮并未促进乳腺癌细胞的明显增生，子宫腺体增生不明显，黄体酮未改变他莫昔芬导致的子宫内膜不典型增生。但本研究的样本量不足，无法统计子宫内膜不典型增生转变为子宫内膜癌的比例，仍需进一步扩大样本量论证。