两栖类种群数量的快速调查与分析方法

熊 姗，张海江，李 成 （1.中国科学院大学，北京 100049；2.中国科学院成都生物研究所，四川成都610041；.大自然保护协会，浙江 杭州 11118）

全球大约20%的陆栖脊椎动物面临着多种威胁并经历着种群快速下降和物种灭绝，包括25%的哺乳类、13%的鸟类、22%的爬行类以及41%的两栖类[1]。对我国两栖类的评估发现我国两栖类受威胁物种达到43.1%[2]。显然，两栖动物的生存境况极其严峻。监测两栖动物种群动态并确定其致危因素是应对危机的关键步骤[3]。为此，我国分别于2011年由生态环境部南京环境科学研究所牵头启动了“两栖类示范观测项目”[4]；在2014年由中国科学院成都生物研究所牵头组织了“中国关键地区两栖爬行动物多样性监测与研究专项网”[5]。至此，我国的两栖动物监测有了规模化的体系，但目前在监测中还存在如下几个问题没有得到较好的解决：（1）两栖动物分布不集中，在制定监测方案时需布设多条样线或样方[6]，人工成本较高。（2）物种的种群数量在季节以及年度间波动较为显著，气候因素对观测结果影响较大[7]，在制定监测方案时需布置2～4个季节的调查[6]，时间成本高。（3）种群数量统计不准确，两栖动物具有较强的季节迁徙习性，由于不能识别个体，只能采用平均个体发现率来代表种群数量。

被动集成应答器（passive integrated transponder，PIT）技术产生后，研究人员在1987年对于黑足鼬（Mustela nigripes）、蒙眼貂（（Mustela putorius furo）的研究中使用了PIT标记，证明了PIT标记对于实现个体识别的有效性[8]，随后PIT标记被广泛运用到野生动物的标记重捕研究中，包括哺乳类[9]、鱼类[10]、鸟类[11]、爬行类[12]以及两栖类[13]。FABER[14]首次采用PIT标记技术研究了高山欧螈（Triturus alpestris），雌螈重捕率为74.6%，雄螈重捕率为82.2%，表明PIT标记重捕法在两栖动物研究中的适用性，开创了将PIT标记技术运用到两栖动物研究中的先河。此后PIT标记重捕法广泛运用于两栖动物种群动态、迁移模式等研究中。

该文介绍了一种利用繁殖点调查法与PIT标记重捕法相结合，获得短期两栖动物重捕数据后，基于开放式种群标记重捕模型的调查与分析方法。以四川省平武县老河沟自然保护区内的中华蟾蜍为代表物种，以5 d野外调查的标记重捕数据，准确快速地估算其种群数量。该方法提供了一种简洁有效的种群数量调查方法，对于珍稀物种的评估具有较高的价值。

1 材料和方法

1.1 研究区域

老河沟县级保护区地处四川省平武县东部，东侧毗邻四川省青川县唐家河国家级自然保护区，北侧与甘肃省文县白水江国家级自然保护区相邻，南部为平武县高村乡，西边与木皮乡、木座乡接壤，地理坐标位为32°36'22″～32°25'52″N，104°32'42″～104°45'25″E。面积约 11 000 hm2。海拔 1 250～3 504 m，相对高差2 200 m左右，地形较复杂，平均坡度30°。该地属于亚热带山地气候，年均温4～12℃，多年平均降水量950～1 300 mm。

1.2 研究对象

中华蟾蜍（Bufo gargarizans）隶属于两栖纲（Amphibia）、无尾目（Anura）、蟾蜍科（Bufonidae）、蟾蜍属（Bufo），主要生活于海拔0～3 500 m的多种生态环境中。每年的3—5月，中华蟾蜍的卵产在临时性、永久性静水塘或流溪的洄水塘内。卵数多，卵径小，发育迅速，从卵孵化到蝌蚪变态上陆仅需2～3个月，季节性的来水即可成功繁殖。蝌蚪为静水型蝌蚪：数量多，个体小，尾较短，尾肌弱，越冬的蝌蚪极为少见。比较适合水温变异幅度大，容易干涸并具有丰富食物的静水环境。成体为陆栖生活类型：体肥壮，后肢粗短，蹠突特别发达，有游离刃，皮肤厚，富于腺体或具瘰粒，生活在土洞内或深埋在水底的泥沙内。中华蟾蜍体型较大，雄蟾体长63～90 mm，雌蟾体长85～116 mm，是我国分布最广的两栖动物物种，也是平原和低山丘陵的常见种[15]；在生活史的各个阶段对环境的适应能力极强[16]。种群数量在繁殖期与非繁殖期波动较为显著[17]；具有较强的季节性迁徙习性，无明显的个体识别特征[18]。中华蟾蜍具有了两栖动物调查3个难点的代表性和典型性。

1.3 研究方法

1.3.1 繁殖点调查法

由于两栖动物是变温动物，生理活动受到环境温度的较大影响。多数的两栖动物具有明显的繁殖期和非繁殖期，需要周期性地聚集到特定的繁殖场所进行繁殖活动。藉此特点，在两栖动物的繁殖季节，在特定的繁殖场所开展集中连续调查，即为繁殖点调查法[19]。在温带地区，两栖动物的繁殖期主要集中在春天和初夏的几周内；在干旱地区，繁殖期集中在短促的雨季；而少数热带地区的两栖动物一年四季都有可能繁殖，繁殖期较不明显。两栖动物在繁殖期的自然聚集，克服了其在非繁殖期分布不集中的难点，因此，繁殖点调查法的效率很高。该法可以用来监测物种种群水平的变化、区系组成在不同时期的变迁，以及个体生态学研究。

繁殖点调查法可以调查成体，也可以调查幼体。然而，幼体的密度受气候和捕食者影响很大，在短期内也会出现很大的变化[20]；READING[21]标记了7 259只刚变态的幼体，仅有48只成年后回到出生的池塘繁殖；因此，幼体的密度并不能预测成体种群的大小。

在老河沟保护区，中华蟾蜍一般在3月开始进入水塘或河流缓流处繁殖，山区水塘集雨而成，干涸较快，卵和蝌蚪死亡很多。2013年在保护区内修建一处人工池塘（32.483 95°N，104.71 967°E，1 373 m），池塘呈梯形，面积为101.25 m2。池塘内引入山溪水，水位常年保持在20～30 cm。池内杂草丛生，雌雄抱对后共同移向合适的产卵地点，卵包裹在管状的胶质卵带内，缠绕在水池的水草上。蝌蚪孵化后主要摄食水池中的水草及落叶。由于面积大、常年有水、幼体食物丰富，吸引了大量的中华蟾蜍和中国林蛙（Rana chensinensis）等两栖动物进入繁殖，因此该池塘成为保护区内重要的两栖动物繁殖点之一。2014年3月12—16日，对该繁殖点的中华蟾蜍成体种群数量开展了短期调查。

图1 中华蟾蜍的繁殖池塘Fig.1 Breeding ponds of Bufo gargarizans

1.3.2 PIT标记重捕法

两栖动物的多数成体在繁殖期间只有较短时间会在繁殖场出现[22-23]。要准确地评估物种的种群数量，则需要采用标记重捕法进行调查。传统的两栖动物标记多为损伤性的个体识别技术，如剪指（趾）、烙印、植入性荧光标记、趾环、彩漆、色斑等[24-27]。BROWN[28]探究了 PIT 标记对两栖动物的影响，结果表明，PIT标记对于两栖动物个体的存活率及身体状况的负面影响可忽略不计。此后，该方法被广泛应用于两栖动物监测和研究，是实现两栖动物标记和个体识别的最佳方法[29]。

PIT标签是一种体积小的玻璃封装的微型芯片，尺寸仅有1.4 mm×8.4 mm，质量为0.06 g。每个标签有唯一的编号，通过将标签注射进动物体内，实现对动物的个体识别，通过多次重捕，快速准确地评估野生两栖动物的种群数量。PIT标记重捕法和繁殖点调查法相结合[30]，可以大幅提高传统监测数据的准确率。

2014年3月12日20点开始，工作人员捕捉进入繁殖场的中华蟾蜍；记录中华蟾蜍的性别、抱对情况、测量头体长、体重、将PIT标签用注射器注射到胯部皮肤与肌肉之间，用医用胶水封闭注射孔，防止电子标签掉落；同时，由于PIT标签有丢失的情况[31-32]，为了正确估算标签丢失率，研究中需要采用2种独立的标记方法进行标记[33]，所以该研究采用PIT为主要标记和剪趾法辅助的综合标记方法，用医用酒精消毒后剪取每只成体最长的第4趾的一节趾骨作为辅助标记，剪趾后使用液体创可贴；全部标记后统一释放回繁殖场。其后的4晚重复相同的工作；运用扫描仪扫描所有个体的PIT编号，记录已标记个体的PIT编号，对未标记的个体注射PIT标签进行标记。

标记重捕法的准确性主要取决于样本量，当重捕几率小时样本量要大于200[34]；该次调查共用PIT标记了212只中华蟾蜍。在5 d的调查期间，仅有1枚标签脱落（表1）。

表1 中华蟾蜍的标记重捕资料Table1 Capture-Mark-RecapturedataofBufogargarizans

1.3.3 分析方法

等捕性检验：个体间具等捕性是标记重捕模型估算种群参数的前提条件。所有的标记重捕模型都是基于以下假设：个体抽样是完全随机的，标记个体与未标记个体有着相同的捕获概率。如果种群个体间不具等捕性，则应用模型估算的种群参数均不可靠[35-36]。因此，应用标记重捕模型分析前首先采用Leslie法对中华蟾蜍个体等捕性进行检验[35]。如再捕获数与再捕获期望值差异显著即表明个体间不具等捕性。

模型选择：经检验，中华蟾蜍个体间满足等捕性条件后，采用R软件（R Core Team 2017）中的RMark包[37]，对中华蟾蜍标记重捕资料进行分析。RMark包提供了100余个利用标记重捕资料估算种群参数的模型[38]。

中华蟾蜍在繁殖期不断地有新的个体进入繁殖场，同时也有个体离开繁殖场，属开放式种群。因此，选择适用于开放式种群的Jolly-Seber模型[39-40]。Jolly-Seber模型有很多适用于短期或长期标记重捕资料的子模型，POPAN模型是Jolly-Seber模型中的一个子模型[41-42]，适用于基于连续的标记重捕资料，估算个体进入繁殖场的迁入率（t）、迁出率（1-φ）、存活率（φ）、重捕率（p）、每晚种群数量（N）、种群总数（NGross）。MADSEN 等[42]在 1987—1991年采用繁殖点调查法对大蟾蜍（Bufo bufo）进行了剪趾标记重捕，运用POPAN模型分别估计了每年的种群数量。该文拟采用该模型适于短期标记重捕资料的计算优势，估算中华蟾蜍繁殖种群数量。

模型结果评估：目前最优的方法是通过比较赤池信息准则（akaike information criterion，AICc）[43]和权重（AICc weight）选择对数据支持度最高的模型；其次，△AICc为该模型与所有候选模型中最小的AICc值之间的差值，△AICc越小，模型越好。当其他模型△AICc＜2时需要对所有△AICc＜2的模型计算结果进行模型平均[44]。

2 研究结果

2.1 捕获量和标记量

2014年3月12—16日，每晚捕获量为40～64只，共标记了212只中华蟾蜍个体，重捕45次，新标记个体数随着总标记个体数的增加逐渐减少（表1）。平均重捕率22.5%，重捕率最低为12.0%，最高为31.7%（表2）。

表2 各取样期的重捕率Table 2 Recaptures of the toads PIT tagged in the date

2.2 中华蟾蜍等捕性

利用Leslie法对中华蟾蜍个体等捕性进行检验，即以取样时点i前个体的被捕获次数（j=0，1，2，…），把在该时点捕获释放的Si只个体分组，然后利用卡方检验（χ2-test）比较i+1时点上述各组的再捕获数（b）与其期望值（E）的差异，差异显著即表明调查种群个体不具等捕性，差异不显著则表明调查种群个体具等捕性。Leslie法对中华蟾蜍个体等捕性检验结果表明，在各取样期不同捕获次数的个体再捕率均无显著差异（χ2=0.79，χ2＜χ0.052=14.07，自由度dƒ=7，P＞0.05），表明中华蟾蜍个体间具等捕性，可满足标记重捕模型估算种群参数的前提条件。

2.3 中华蟾蜍种群数量

迁入率（t）、存活率（φ）、重捕率（p）是利用POPAN模型计算种群数量的3个重要参数，将3个参数分别定义为常数值（～1）或随时间变动的值（～time），共产生8个随机模型，然后用标记重捕数据分别进行拟合。拟合结果显示，在8个随机模型中，φ和p为常数、迁入率随时间变化的模型2的AICc值最低，权重值为0.52，为最优模型；其次是模型1，其△AICc值为1.87（表3）。由于2个模型的△AICc＜2，需对2个的模型计算结果进行平均，则中华蟾蜍每晚在繁殖场的种群数量为252～377只，繁殖种群总数为（641±86）只（表4）。

3 讨论

3.1 蟾蜍的适应能力和濒危现状

全球两栖动物共有7 968种，其中蟾蜍科有617种（www.amphibaweb.org），是全世界分布最广的科级两栖动物，占据着多种不同的栖息地。VAN BOCXLAER等[45]对蟾蜍科的进化史进行了重构，发现7个性状推动了蟾蜍的全球扩张。7个性状包括：（1）适应缺水的环境；（2）有毒腺，防止被捕食；（3）体内存储了大量脂肪，能量足；（4）个体相对较大，体表面积比值小，失水少；（5）繁殖场所灵活多样；（6）卵的数量大；（7）蝌蚪属外部营养型，自主觅食，不需要母亲提供能量。大多数原始蟾蜍都有这些特性，从而使该群体拥有了扩大分布区的能力。

蟾蜍虽然具有强大的扩散和适应能力，然而其生存状况却不容乐观。对全球5 743种两栖动物的评估结果显示[46]，32.5%（1 856种）的两栖动物受到灭绝威胁；而在评估的461种蟾蜍科物种中，45.6%的蟾蜍受到灭绝威胁。中国的蟾蜍科共20种，7种（35.0%）受到灭绝威胁[2]。

中华蟾蜍是我国分布最广的两栖动物，数量大，食性广，是农田和森林里最重要的生态益虫之一[47]。由于其分布面积大、数量多、迁移能力强，只能通过繁殖期的集中调查评估其种群数量；而在非繁殖期，由于中华蟾蜍长距离的迁徙、分散觅食，调查难度非常大。通过对中华蟾蜍繁殖期的种群数 量评估对于其他两栖动物调查也有启示意义。

表3POPAN模型筛选结果Table 3 Model selection results from the POPAN model

表4 基于POPAN模型的中华蟾蜍种群数量Table 4 Population size estimates from the POPAN model

3.2 复合型调查方法的优势和不足

监测方法对监测指标和数据质量具有重要影响。通常两栖动物监测中使用的监测方法有样线法、样方法、围栏陷阱法等[5-6]。以物种多样性监测为例，对佛罗里达州的22种两栖类进行了调查方法比较[48]，结果发现：遇见法发现12种，样方法发现6种，围栏陷阱法发现7种。

以种群密度和动态监测为例，在研究卵齿蟾属（Eleutherodactylus）种群密度和种群动态时发现[34]：遇见法与样线法得到的种群密度较低，而且对种群动态的预测结果偏差大；标记重捕法得到的种群密度也较低，但对种群动态的预测结果较准确。遇见法的预测准确率为0.10～0.52，样线法是0.27，标记重捕法的预测准确率为0.35～0.61。研究表明，标记重捕法的评估结果更精确，偏差更小，而且能够及时有效地监测种群数量和动态[49]。

物种的种群数量和动态是确定濒危等级，制定保护物种名录的重要依据[50]。谢锋[51]采用繁殖点调查法和标记重捕法调查了国家二级保护动物镇海棘螈（Echinotriton chinhaiensis）的种群数量。繁殖点调查法发现1997、1998和1999年雌性个体总数分别是50、88、89只；对发现的部分个体剪指（趾）标记，1997、1998和1999年分别剪指（趾）标记了31、53、54只，重捕后经Petersen估计模式推算，1998年的雌性种群数量为（156±30）只，1999年的雌性种群数量为（181±11）只。正是基于对镇海棘螈种群数量的准确评估结果，2000年国家林业局启动了镇海棘螈保护小区的规划和建设，为我国的濒危物种保护建立了科学示范。

通过标记来实现个体识别，通过多次重捕以提高预测准确率，标记重捕法是一种较好的物种多样性和种群动态监测方法[52]。谢锋等[53]特别指出，每种监测方法的适用类群不同，监测指标各异，在野外工作中同时采用2～3种方法可以更好地监测物种多样性和种群的变化。在标记重捕研究中，应用PIT标记有以下优点：（1）保留率高：监测期间，仅有一个个体标签脱落；（2）识别精确：标签编号具有唯一性，不会出现误读的情况，而剪指（趾）法、烙印等标记随着标记时间的增加而错误识别的几率也会增加；（3）负担小：电子标签重量仅0.06 g；（4）使用寿命长，适用于中长期标记重捕研究。但PIT标记在对两栖动物标记时有着以下局限：（1）标签会在动物体内移动，可能会导致误认为标签丢失；（2）不适用于体型过小的两栖动物（体重小于2 g）[54]，尤其是两栖动物幼体[29]。

繁殖点调查法与标记重捕法相结合的复合型调查方法有如下优点：繁殖点调查法利用了两栖动物集群繁殖的生物学习性，克服了个体分布不集中的难点，捕捉难度小，人工成本低；在较短的、较固定的繁殖期进行调查，以繁殖种群为调查对象，减小了不同季节的种群数量的波动，调查时间也大大缩短；PIT标记实现了个体识别，对动物个体的伤害较小，可以得到较长期和较准确的种群动态数据，以及生长、运动迁移、健康状况等信息。该方法适用于在临时性的池塘、或者永久性的池塘、或溪流中的两栖动物的繁殖种群调查；尤其对于繁殖期明显，短期内聚集，爆发式繁殖的广布种非常有效；对于狭域分布的、数量较少的珍稀物种的快速评估也具有很高的价值。

该复合型调查方法不能准确监测的情况如下：（1）繁殖期较不明显的物种，如热带地区一年内多次繁殖的物种；（2）繁殖点较分散的物种，如水树蛙属（Aquixalus）的物种；（3）个体太小不能携带PIT标签的物种，如水蛙属（Hylarana）、浮蛙属（Occidozy‑ga）、姬蛙属（Microhyla）、水树蛙属（Aquixalus）、纤树蛙属（Gracixalus）的物种。

3.3 POPAN模型用于种群数量分析的优越性

目前，常用的标记重捕模型有Lincoln-Index模型、Jolly-Seber模型、POPAN模型、Robust Design模型等。Lincoln-Index模型是最简单的标记重捕模型，只需要一次标记、一次重捕所获得的数据就可以估计种群数量，但只适用于无出生、死亡、迁入、迁出个体的封闭式种群，并且所获得的结果误差较大[55]。而野外种群大多是开放式种群，Jolly-Seber法被认为是研究开放式种群最好的方法之一[56]。POPAN模型就是属于Jolly-Seber法的一个模型，能够基于≥4 d的标记重捕数据估算种群数量等参数；而Jolly-Seber模型的其余子模型仅能估算存活率、迁入率等参数，无法估算种群大小。Robust Design模型则结合了开放式种群和封闭式种群的特点，但在估算种群数量等参数时需要重捕周期发生在不同时间尺度（年、月、日）上，每一次重捕周期内有≥2次重捕[57-59]。因此，在重捕周期仅有一个时间尺度上的情况下，要获得种群数量等参数时，POPAN模型是最适用的标记重捕模型。

CITTA 等[40]在研究白鲸（Delphinapterus leucas）的种群动态时，模拟了不同迁移率水平下的标记重捕数据，然后运用这些数据跟POPAN模型进行了拟合。结果表明，POPAN模型所估算的种群数量结果95%的置信区间都包含了模拟的种群数量，表明POPAN模型适用于标记重捕数据，拟合的结果较为准确。但在该研究中，采用的是遗传标记，重捕时出现了识别模糊的情况，对种群数量估算有一定的影响。而这次对中华蟾蜍采用了PIT和剪趾的复合标记方法，标记的212只个体在5 d的重捕周期中仅有一个个体出现标签丢失的情况；并且每个PIT标签都有唯一的电子编号，没有识别错误；因此，运用POPAN模型对中华蟾蜍种群数量的估算结果因PIT标记实现了对个体的准确识别，对中华蟾蜍种群数量的估算更准确。

致谢：四川省平武县老河沟保护区的陈祥辉、蔡兴贵、舒成、张海江、强国权、胡小梅、向遵忠、杜惠、吴红等协助调查工作，中国科学院成都生物研究所陈有华研究员指导模型选择和分析，Janak Raj Khatiwada博士校订英文摘要，特此致谢。