四川省山药黑斑病病原菌的鉴定

韩帅 张河庆 吴婕 李洪浩 席亚东

摘要为鉴定引起山药茎蔓黑斑病的病原菌，本研究利用柯赫氏法则验证其致病性，根据菌株的形态特征和基于rpb2基因序列分析进行分类鉴定，并初步测定其寄主范围。结果显示：分离的2株病原菌分生孢子椭圆形，单胞，（3.9～5.1）umX（1.8～2.7）um，产孢细胞瓶梗形，分生孢子器近圆形或梨形，无刚毛，具孔口，有时孔口延长形成乳突，NaOH颜色反应呈阳性，参考Phoma鉴定手册，可将其划分到section Peyronellaea。将供试茵的rpb2序列进行BLAST比对分析，其与GenBank中的Epicoccumlatusicollum具有最高的同源性，支持率为97%，结合形态学特征可将其鉴定为E latusicollum，该菌经人工接种后也能侵染番茄、辣椒和花菜幼苗。

关键词山药黑斑病;病原鉴定;附球菌属;rpb2序列分析

中图分类号：S435.39文献标识码：A D01：10.16688/j.zwbh.2018156

山药又名薯蓣，是一种药食两用的多年生草质藤本植物，在我国的西北、华北及长江流域均有广泛种植。由于山药具有较高的营养价值和药用价值，近年来种植面积不断扩大，加上单一连作的栽培模式使病害逐年加重。在山药栽培管理过程中常见的病害有枯萎病、褐斑病、炭疽病、根腐病，此外茎腐病、斑枯病、漆腐叶斑病也时有发生，这些病害已严重影响到山药的产量和品质。

茎点霉属Phoma真菌拥有丰富的生态多样性，通常被认为是种类最多的真菌类群之一，已命名和描述的超过3000种。早期学者主要依据寄主类群和培养性状来进行分类，对于形态差异较小的物种，形态分类就显示出一定的局限性。2004年Boerema等编写出版了《Phoma Identification Manual》，将厚垣孢子、产孢细胞、分生孢子和分生孢子器的形态学特征、菌落的培养性状、NaOH颜色反应以及寄主范围作为分类依据，重新整理和修订了茎点霉属真菌，并将其分为九大部分，根据编制的检索表可将供试菌划分至其中一个部分，再划分到种。这为供试菌在种属水平上的准确鉴定提供了有效的帮助，但部分分类单元之间的划分界限仍然比较模糊，鉴定过程中供试菌可能同时拥有几种分类单元的特征。分子生物学的快速发展为微生物的分类鉴定提供了新思路和新方法，Aveskamp等利用4个基因（LSU、SSU、ITS、tub2）对亚隔孢壳科Didy-mellaceae进行多位点系统发育研究，对该科几个单系进化支进行了分类学修订，将原本属于广义茎点霉section Peyronellaea部分的Ph.sorghina、Ph.pimprina和E.nigrum转至新建立的附球菌属Epicoccum，该属的典型特征为能够产生深色的葡萄串状的厚垣孢子。Chen等将rpb2与LSU、ITS和tub2三个位点结合进行多位点系统发育分析，对附球菌属进行了修订和补充，加入了5种不产生厚垣孢子的原茎点霉属真菌。随后，Chen等使用相同方法对附球菌属进行了再次补充和完善，将9个新种纳入其中，其中包括E latusicollum、E.viticis和E.duchesneae等5个不产生厚垣孢子的新种。关于附球菌属真菌的研究主要集中于生物防治方面，CampbellEl62研究发现，黑附球菌E.pur-purascens对小麦禾旋孢腔菌Cochliobolus sativus有拮抗作用;室内试验表明，黑附球菌可以减少核盘菌Sclerotinia sclerotiorum对莴苣的侵染;Mel-garejo等的研究表明，E nigrum能够有效抑制桃褐腐菌Monilinia laxa;李宝年等认为附球菌属真菌对樟子松枯梢病病原菌Diplodia pinea具有拮抗作用。近几年来，也有报道称附球菌属真菌能引起作物病害，E sorghinum会造成高梁根部变黑腐烂和种子腐烂，E.nigrum能引起枇杷叶片的褐斑病。

本研究于2016年从四川省攀枝花市米易县采集山药病样，发现茎蔓上一种新的病害，采用柯赫氏法则回接验证，依据病原菌的菌落形态、分生孢子和分生孢子器的形态特征，結合rpb2基因序列建树比对分析，确定病原菌的种类，从而为山药病害的准确识别和药剂防治提供重要的理论依据。

1材料和方法

1.1植物材料和供试菌株

植物材料：山药品种为‘雅山一号，病样采自攀枝花米易县垭口镇和丙谷镇。辣椒品种为‘香辣二荆条，花菜品种为‘碧玉，番茄品种为‘大红番茄。供试菌株（编号为SY11和SY12）均从山药发病茎蔓分离获得，经过单孢纯化保存于4C冰箱备用。

1.2培养基

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextroseagar，PDA）培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水1000mL;水琼脂培养基：琼脂6g，蒸馏水1000mL;燕麦琼脂（oatmeal agar，OA）培养基：燕麦片20g，琼脂12g，蒸馏水1000mL;麦芽浸膏（malt extract agar，EMA）培养基：麦芽膏40g，琼脂12g，蒸馏水l 000mL。

1.3主要试剂

试剂及仪器：十六烷基三甲基溴化铵（hexade-cyl trimethyl ammonium bromide，CTAB），乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），Taq PCR Master Mix，北京擎科新业生物技术有限公司;Loading Buffer，生工生物工程（3c海）股份有限公司。

1.4病原菌的分离和纯化

采用常规组织分离法进行病原菌的分离。病样用清水冲洗干净，自然风干，使用消毒剪刀截取病健交界处5mmX 5n3In的组织块，75%乙醇浸泡1min，然后用5%次氯酸钠处理30s，无菌水漂洗3次后用无菌滤纸吸干水分，将组织块接种至PDA平板上，25℃黑暗培养。

菌株纯化采用单孢分离法。收集菌株的分生孢子器，机械压破后加入适量无菌水，取上清制成一定浓度的孢子悬浮液，均匀地涂布于PDA平板上，25℃黑暗培养3～4d挑取单菌落，转接于PDA斜面上，获得纯菌株，待长满后4C保存。

1.5病原菌的形态学鉴定

将活化的纯菌株转接于OA、EMA和PDA培养基上，25℃黑暗培养7d，测定菌落直径，并记录菌落的形态特征，同时在菌落边缘滴加适量的10%NaOH溶液，在10min和1h后观察并记录培养基的颜色变化。黑暗培养7d后，将平板转移至12h黑光灯照射、12h黑暗处理的人工气候培养箱中，25℃培养7d，诱导分生孢子器的产生，在光学显微镜下观察分生孢子、厚垣孢子和分生孢子器的形态特征，并测定20个分生孢子的大小，根据《PhomaIdentification Manual》中关于生长速度、颜色反应以及分生孢子、分生孢子器和产孢细胞的形态特征等描述细则来进行形态学鉴定。

2.5病原菌寄主范围的研究

菌株SY11和SY12接种番茄苗茎基部3d后，菌饼周围出现一圈水渍状病斑，6d后病斑变为褐色，扩展至整个茎基部，稍有缢缩，发病率为100%;接种辣椒苗4d后，接种部位开始变褐，6d后病斑扩大并且凹陷，其发病率分别为85%和90%;接种花菜幼苗4d后，接种部位出现不规则褐色病斑，6d后病斑中心变为黑色，表面密布白色菌丝，其发病率分别为70%和80%;SY11接种豇豆苗未发病，SYl2发病率为10%，症状表现为粉色的稍凹陷病斑。结果表明，两个菌株能侵染辣椒、番茄和花菜，它的寄主范围可能包括茄科和十字花科作物，但对豇豆的侵染力非常有限。

3讨论

山药是四川攀枝花米易县重要的经济作物之一，近年来由于山药的规模化种植，重茬严重，品种也较为单一，病害日益加重，经过病害调查和鉴定，当地由胶孢炭疽菌引起的炭疽病、尖孢镰刀菌和链格孢属真菌引起的叶斑病较为常见。我们在山药茎蔓上发现了一种新病害，症状为茎蔓生有椭圆形至梭形的黑斑，病斑中心开裂稍凹陷，之后连成一片至茎蔓枯死。本研究对引起攀枝花山药茎蔓黑斑病的两株真菌进行了分离和鉴定，并通过柯赫氏法则验证分离菌株为致病菌，经过形态学特征和基于rbp2序列的分子鉴定，确定分离菌株为E.1atusicollum，属于子囊菌门、亚隔孢壳科、附球菌属真菌。

附球菌属于2010年由Aveskamp等建立，经过后续的补充和完善，现有16个属。Chen等通过多基因序列分析，将E.1atusicollum纳入到附球菌属中，并对菌株编号为LC 5158（从高梁中分离获得）的E latusicollum的形态学特征和菌落培养性状作了描述。本研究分离到的菌株SYll和SYl2与LC 5158形态学特征基本一致，也和Phoma鉴定手册对section Peyronellaea的描述基本相符，只是未见厚垣孢子，但能观察到菌丝中问或末端分化出的串珠状的近圆形膨大细胞，有的呈粉色，与Ph.anserina和Ph.eucalyptica在培养基上形成的膨大细胞类似，这可能是形成厚垣孢子的前体细胞。同时，SYll和SYl2在PDA培养基上的生长速度快于OA和MEA培养基，NaOH反应是由墨綠色逐渐转变为棕色，呈阳性，这与LC 5158培养性状一致，但是菌丝颜色和产生的色素有所不同，SYll和SYl2的菌丝呈橙色或粉色，培养基呈浅粉色至紫色，且SYl2能产生紫红色的同心轮纹，而LC 5158的菌丝为烟灰色至暗绿色，这可能是因为E.1atusicollum的地理特异性较明显。

通常情况下，子囊菌门真菌rpb2单基因的系统发育关系与18S rDNA高度契合，Chen等认为rpb2单基因的系统发育树与多基因结合的系统发育树非常吻合，且rpb2基因在种问和属问关系上显示出比ITS更好的区分度。本研究利用rDNA-ITS和rpb2基因分别进行建树分析，结果显示基于ITS序列构建的系统发育树（本文未列出）不能鉴定到种，而rpb2基因能将分离菌株与附球菌属的E latusi-collum聚为一支，并且在种问表现出很好的区分度。

国内外关于E latusicollum的报道极少，目前仅限于分类水平上的研究，只是在个别文献中有所提及，该菌主要分离自黄荆、野山茶、高梁、掌叶槭和罗汉松等植物，常被认为属于内生菌、腐生菌或半寄生菌，对该菌病理学方面的研究较少。本研究首次报道了山药茎蔓上的一种新病害，通过组织分离、柯赫氏法则验证、形态学鉴定和分子生物学鉴定，试验结果表明引起山药茎蔓黑斑病的病原菌为E.la-tusicollum，并初步确定该菌能侵染茄科和十字花科的个别作物，这为该病害的正确识别及防治方法的筛选提供了基础。