UPLC 法测定不同海拔及不同采收期乌梅中枸橼酸和苹果酸

群 培， 翟 雪，2， 金 乾， 杨正明，3∗， 刘 圆

（1.西南民族大学药学院，四川 成都610041；2. 四川省广安市岳池县农业局，四川 广安638300；3.四川农业大学农学院，四川 成都611130；4.西南民族大学民族医药研究院，四川 成都610041）

乌梅为蔷薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.et Zucc. 的干燥近成熟果实。始记载于《神农本草经》［1-2］，其味酸， 性平无毒， 归肝、 脾、肺、大肠经［3-4］，有敛肺、涩肠、生津、安蛔、增强机体的免疫功效。用于治疗肺虚久咳、久泻久痢、虚热烦渴、便血尿血等症［4-7］，在我国中药及民族药中已广泛使用。关于乌梅的入药形式，历代本草及相关标准记载中均有去核和连核使用2 种，现代相关研究证明乌梅中的有效成分有机酸及水浸出物大多集中在果肉中，核中含有量甚少［8］。乌梅除作药物使用外，还可制作果脯、饮料等，是国家公布的1 种重要的药食两用传统药材，也被广泛应用于清咽类保健食品中［9-11］。

乌梅除含有氨基酸、黄酮、挥发油、生物碱、甾醇类外，还含有丰富的有机酸［12-13］，如枸橼酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、乳酸、草酸等，具有软化血管、 防老抗衰、 抗菌、 抗变态反等作用［14-15］。临床用于肺虚久咳、久痢滑肠、虚热消渴、蛔厥腹痛等症［16］。多年以来，历版《中国药典》 对乌梅药材的优劣鉴别多以有机酸（以枸橼酸计） 含有量为质量控制指标，并且课题组前期研究发现，乌梅中有机酸含有量最多为枸橼酸和苹果酸，为其主要成分，具有抑菌、抗惊厥、抗病毒、抗肿瘤和抗氧化、止血、降低血脂和降血糖等多种药理作用［17-19］。 王璐等［16，20］研究表明降血糖作用与乌梅中的苹果酸和枸橼酸有关。枸橼酸广泛应用于食品饮料、医药化工、清洗与化妆品、有机材料等领域，是目前世界上需求最大的有机酸；苹果酸广泛分布于动物、植物及微生物细胞中，具有抗疲劳、改善记忆力、保护心脏等作用，同时在食品领域也发挥着巨大作用。本研究建立UPLC 法测定不同海拔、不同采收期乌梅果实（去核） 中苹果酸和枸橼酸的含有量，以期为其临床应用和新药开发以及食用方面提供参考。

1 材料

1.1 仪器与试剂 Waters Acquity UPLC©H-Class

超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）；DHG-9246A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）；JY-02 多功能粉碎机（永康浩瀚工贸有限公司）；METTLER TOLEDO TYPE AE240S 电子分析天平［瑞士梅特勒-托利多仪器 （上海） 有限公司］；KQ-5200E 型超声波清洗器（40 kHz、250 W，昆山超声仪器有限公司）。

枸橼酸对照品（批号MUST-14091701）、苹果酸对照品（批号MUST-14100803） 均购于成都曼思特生物科技有限公司；乙腈为色谱纯（美国迪马公司）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.2 药材 梅果实样品采集于四川省阿坝藏族羌族自治州金川县，经西南民族大学刘圆教授鉴定为蔷薇科植物梅Prunus mume（Sieb.） Sieb. et Zucc.的果实，见表1。样品经去核、烘干粉碎后，过2号筛，备用。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ACQUITY HSS C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脱，洗脱程序见表2；体积流量0.2 mL／min；检测波长210 nm；进样量1 μL；柱温35 ℃。分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液进样，色谱图见图1。

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2 溶液制备与标准曲线绘制

2.2.1 对照品溶液制备 分别称取枸橼酸、苹果酸对照品适量，精密称定，甲醇溶解定容至10 mL量瓶 中， 即 得2.056、 2.020 mg／mL 的 对 照 品母液。

2.2.2 供试品溶液制备 取0.5 g 干燥至恒定质量的梅果实（去核） 粉末，精密称定，加入20 mL 80%甲醇溶液，超声提取100 min，摇匀，过滤，取续滤液5 mL，减压回收溶剂至干，残渣用少量甲醇溶解并定容于10 mL 量瓶，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 标准曲线绘制 分别精密吸取枸橼酸和苹果酸对照品母液，用甲醇稀释，并定容至2 mL，得系列质量浓度的对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下，以进样量为横坐标（X）、记录色谱峰峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，以信噪比S／N=3作 为 检 出 限 （LOD）， S／N=10 作 为 定 量 限（LOQ），结果见表3。

图1 各成分UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一苹果酸和枸橼酸混合对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下连续进样6次，测得峰面积RSD 分别为0.82%、0.90%，表明该仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 称取同一乌梅果实（去核）粉末（S1）6 份，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样，记录峰面积，得枸橼酸、苹果酸含有量RSD 分别为0.88%、0.78%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 称取乌梅果实（去核） 粉末（S1），按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下，分别于1、3、5、7、12、24 h进样，得枸橼酸、苹果酸含有量RSD 分别为1.44%、1.35%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.4 加样回收率试验 取已知含有量的梅果实（去核） 粉末 （S1） 0.01 g，精密称定6 份，加入适量枸橼酸和苹果酸对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下测定，计算回收率，结果见表4。

表4 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.4 样品含有量测定 精密称取梅果实（去核）不同海拔、不同采收期样品粉末（过4 号筛） 各0.5 g，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进行测定，计算枸橼酸和苹果酸的含有量，结果见表5，不同海拔、不同采收期的乌梅果实中枸橼酸和苹果酸含有量变化趋势见图2～3。

表5 样品中枸橼酸和苹果酸含有量测定n=3）Tab.5 Determination of citric acid and malic acid content in the fruits of samples

表5 样品中枸橼酸和苹果酸含有量测定n=3）Tab.5 Determination of citric acid and malic acid content in the fruits of samples

编号 枸橼酸 苹果酸 总和S1 103.68±0.02 114.68±0.17 218.36±0.19 S2 108.96±0.05 121.96±0.09 230.92±0.14 S3 114.79±0.12 116.79±0.02 231.58±0.14 S4 116.35±0.07 113.35±0.09 229.70±0.16 S5 143.31±0.04 154.68±0.11 297.99±0.15 S6 159.96±0.06 148.96±0.12 308.92±0.18 S7 167.79±0.18 138.79±0.04 306.58±0.22 S8 168.35±0.06 131.35±0.05 299.70±0.11 S9 144.21±0.05 156.12±0.13 300.33±0.18 S10 153.28±0.02 150.31±0.07 303.59±0.09 S11 164.55±0.14 140.29±0.05 304.84±0.19 S12 162.22±0.05 132.45±0.11 294.67±0.16 S13 146.73±0.02 155.72±0.23 302.45±0.25 S14 155.46±0.04 149.24±0.08 304.7±0.12 S15 167.35±0.13 140.05±0.02 307.4±0.15 S16 165.03±0.06 134.93±0.09 299.96±0.15 S17 149.18±0.01 154.83±0.15 304.01±0.16 S18 158.37±0.09 148.54±0.13 306.91±0.22 S19 168.95±0.17 141.17±0.04 310.12±0.21 S20 166.44±0.08 136.43±0.10 302.87±0.18 S21 147.99±0.02 152.56±0.14 300.55±0.16 S22 156.87±0.09 146.22±0.05 303.09±0.14 S23 167.71±0.15 140.33±0.08 308.04±0.23 S24 164.40±0.05 137.14±0.03 301.54±0.08 S25 148.11±0.03 151.96±0.19 300.07±0.22 S26 157.08±0.05 144.27±0.05 301.35±0.1 S27 167.54±0.12 139.83±0.06 307.37±0.18 S28 164.32±0.03 136.74±0.05 301.06±0.08

图2 不同采收期样品中枸橼酸和苹果酸含有量变化趋势Fig.2 Variation tendency of citric acid and malic acid in samples from different gathering periods

3 讨论与结论

图3 不同海拔和不同采收期样品中枸橼酸和苹果酸含有量变化趋势Fig.3 Variation tendency of citric acid and malic acid in samples from different altitudes and different gathering periods

本实验采用UPLC 法对不同海拔、不同采收期的乌梅中枸橼酸和苹果酸进行含有量测定，结果表明海拔2 920 m 的样品中两者含有量明显低于海拔小于2 400 m 的样品；海拔2 920 m 的样品中枸橼酸含有量为103.68 ～116.35 mg／g，低于药典规定的“不得小于12.0%”，而海拔低于2 400 m 的样品中枸橼酸含有量远高于药典要求；从5 月至8月，样品中枸橼酸含有量随着月份的增加呈上升趋势并趋于平衡，而苹果酸的含有量随着月份的增加呈下降趋势。课题组前期查阅相关文献得，这2 种有机酸与乌梅药理作用关系密切，可将其列入乌梅及其制剂质量标准控制的项目。药理作用极其广泛，化学成分也十分复杂，早期果实（去核） 中枸橼酸含有量低于苹果酸，随着果实成熟，枸橼酸的含有量呈逐渐增加趋势，至后期枸橼酸含有量略高于苹果酸［18-20］。对枸橼酸和苹果酸含有量而言，乌梅栽种在海拔2 400 m 以下的地区为宜，且以7至8 月采收期为最佳。

课题组分别考察了加热回流和超声提取，结果表明超声提取效果优于加热回流提取，故采用超声提取；分别考察了甲醇、水、乙醇3 种不同溶剂的提取效果，结果表明以甲醇作为提取溶剂，枸橼酸和苹果酸含有量总和最高，故选择甲醇作为提取溶剂；分别考察不同体积分数（50%～100%） 甲醇的提取效果，结果表明甲醇体积分数为80%时，枸橼酸和苹果酸含有量总和最高，故选择80%甲醇；分别考察了不同料液比（1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50） 的提取效果，结果表明料液比为1 ∶40 时，枸橼酸和苹果酸含有量总和最高，故选择料液比为1 ∶40；分别考察了超声30、60、80、100、120 min 的提取效果，结果表明当超声时间100 min 时，枸橼酸和苹果酸含有量总和最高，故选择超声时间100 min。结合多方法学考察，表明该方法准确稳定，重复性好，可用于乌梅的质量控制。