泥附子商品等级划分合理性分析
2019-07-23贺亚男林俊芝张定堃
李 潘, 贺亚男, 罗 杰, 裴 瑾,2, 林俊芝, 杨 明, 张定堃,2∗
(1.成都中医药大学药学院,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地,四川成都611137;2.四川好医生攀西药业有限责任公司,四川 西昌615000;3.成都中医药大学附属医院,四川 成都610072;4.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室,江西 南昌330004)
商品规格等级是中药品质的重要外观标志,也是中药材“辨状论质” “看货评级,分档议价” 的重要指标,在中药材市场流通领域具有不可替代的作用 [1-3]。为此,1984 年颁布了《七十六种药材商品规格》,为中药质量评价与市场流通起到重要作用。然而,中药材生产方式发生了重大变化,栽培品大量取代野生品成为市场供应主流来源。同时,现代理化分析技术不断发展与普及应用,传统中药材商品规格的科学性也备受质疑[4-7]。因此,有必要对中药材商品规格等级划分的合理性进行再认识与再评价。
附子是毛茛科乌头属植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根,是确有疗效的有毒中药。其毒烈,不少医家避之如蛇蝎,终生不敢使用;其效彰,被誉为“回阳救逆第一品”,治病保命“药中四维”[8-9]。因此,研究影响附子毒效的因素是药材品质优良,用药安全的重要保障。
关于附子的品质,从宋代起就有评价方法的论述。 《彰明附子记》 中记载,泥附子一般以“底平”“体圆” “皮黑” “肉花白” “八角” 或“九角” 者为佳;在质量上, “一个重一两,即是气全,堪用”。近几十年来,关于泥附子感官评价的指标趋于简化,如《七十六种药材商品规格》主要以质量为评价[10-12]。在产地,附子收获后也按照个头大小分档销售、加工炮制。大附子用于加工炮天雄,作为温肾助阳之佳品;中等个头附子用于加工白附片、黑顺片等,作为附子的主流饮片规格;小个头附子直接干燥后充当川乌,作为祛风湿止痛药。因此,深入探讨个头大小对附子毒效的影响规律,对于研究商品规格等级的合理性与科学性,指导附子种植、采收、良种选育、市场流通与临床应用均具有重要意义。
1 材料
1.1 药材 泥附子于2017 年6 月27 日采集于四川省江油市桥楼村GAP 种植基地的同一地块,根据个头大小,将附子分为5 个等级,分别为Ⅰ等0 g<质量<20 g、Ⅱ等20 g<质量<40 g、Ⅲ等40 g<质量<60 g、Ⅳ等60 g <质量<80 g、Ⅴ等质量>80 g。样品经成都中医药大学药学院裴瑾教授鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根,外观性状见图1。样品洗净、切片、冷冻干燥,粉碎过2 号筛,备用。阿司匹林肠溶片,由拜耳医药保健有限公司生产,批号J20171021,使用前用0.5%CMC-Na 溶液配成阿司匹林混悬液。
图1 不同等级样品外观性状Fig.1 Appearances of different grades of samples
1.2 试剂 乌头碱、新乌头碱、印乌头碱、次乌头碱、乌头原碱、尼奥林、松果林、塔拉乌头胺对照品均购于成都曼斯特生物有限公司,批号分别为MUST-16062206、 MUST-16032504、 MUST-16101810、MUST-16032106、 MUST-16060306、 MUST-16052503、MUST-17022505、MUST-16031801; 苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、附子宁、去甲乌药碱、去甲猪毛菜碱对照品购于成都克洛玛生物科技有限公司,批号分别为CHB160912、CHB151203、 CHB160326、 CHB160812、 CHB151111、CHB160922,所有对照品含有量均>98%。色谱级二甲亚砜和甲酸购于成都市科龙化工试剂厂;超纯水(自制); 甲醇、 乙腈 (色谱纯, 美国Fisher 公司);屈臣氏蒸馏水购于广州屈臣氏食品饮料有限公司;其余试剂均为分析纯。
1.3 动物 KM 小鼠,SPF 级,体质量18 ~22 g,雌雄各半;SD 大鼠,雄性,体质量180 ~200 g,均由成都达硕实验动物有限公司提供,动物质量合格证号SCXK(川)2015-030,检疫后备用。将动物保持在温度(20±0.5)℃,湿度(55±5)%和12 h光照和12 h 黑暗循环的受控条件下,在实验之前,动物禁食24 h,可自由饮水。
1.4 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪、Agilent 6460C 三重四极杆串联质谱仪 (美国Agilent 公司);BP211 DAG 电子分析天平(德国Satorius 公司);CHRIST ALPHAI-4 LSC 冷冻干燥器(上海斯高勒生物科技有限公司);KQ-500DB型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);SZ-93 A 自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。
2 方法与结果
2.1 含有量测定
2.1.1 供试品溶液制备 取样品粉末各0.1 g,精密称定,置10 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,称定质量,超声提取30 min,取出,放冷,精密称定,补足减失质量,过0.22 μm 微孔滤膜,即得。
2.1.2 对照品溶液制备 分别取各对照品适量,精密称定,用甲醇配制成含14 种生物碱的混合对照品于棕色量瓶中, 质量浓度分别为乌头碱1.905 μg/mL、新乌头碱10.2 μg/mL、次乌头碱2.032 μg/mL、印乌头碱0.464 μg/mL、苯甲酰乌头 原 碱 0.672 μg/mL、 苯 甲 酰 新 乌 头 原 碱1.932 μg/mL、苯甲酰次乌头原碱0.18 μg/mL、乌头原碱0.104 μg/ mL、附子宁4.32 μg/mL、尼奥林2.032 μg/mL、塔拉乌头胺0.33 μg/mL、松果林2.904 μg/mL、去甲乌药碱0.134 μg/mL、去甲猪毛菜碱0.416 μg/mL。储存于4 ℃的冰箱中,备用。
2.1.3 分析条件
2.1.3.1 色谱条件 Phenomenex C18色谱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0 ~1 min,2%~20%B;1 ~5 min,20%~50%B;5 ~10 min,50%~75%B;10~15 min,75%~100%B);体积流量0.45 mL/min;柱温30 ℃;进样量5 μL。
2.1.3.2 质谱条件 采用ESI 源,正离子模式检测;脱溶剂温度300 ℃;脱溶剂气流N211 L/min;雾化器压力103.425 kPa;毛细管电压4 000 V;扫描方式为MRM 检测,14 种生物碱成分的多反应监测模式信息见表1,MRM 色谱图见图2。
表1 各成分多反应监测模式信息Tab.1 MRM information of various constituents
2.1.4 方法学考察 参照ICH Q2B 技术指导原则进行。取对照品溶液适量,用甲醇稀释为不同质量浓度梯度的对照品溶液,在拟定的HPLC-MS/MS条件下测定。以待测物质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归。同时测定各待测物的定量限(S/N=10) 和检测限(S/N=3),各成分线性关系、LOD 和LOQ 的结果见表2。精密度、稳定性、重复性与加样回收率前期已研究[13],表明该方法能满足含有量测定的要求。
表2 各成分线性关系、LOD 和LOQTab.2 Linear relationships,LOD and LOQ of various constituents
图2 各成分MRM 色谱图Fig.2 MRM chromatograms of various constituents
图3 不同等级附子的含有量测定结果Fig.3 Results of content determination of Aconite with different grades
表3 各成分含有量测定结果(μg/g,n=6)Tab.3 Results of content determination of various constituents(μg/g,n=6)
2.1.5 样品含有量测定 取5 个不同等级的附子粉末,按“2.1.1” 项下方法制备样品溶液,每个样品平行制备6 份。在“2.1.3” 项条件下进样,计算各供试品溶液中14 种生物碱的含有量,结果见表3。可知,不同等级附子中成分含有量具有显著差别。随着附子质量的增大, 双酯型生物碱(乌头碱、新乌头碱、印乌头碱) 与强心成分(去甲乌药碱、去甲猪毛菜碱) 的含有量分别呈现降低、升高趋势,单酯型生物碱(苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱) 含有量较低,无法比较组间差异, 其余5 种药效成分(尼奥林、塔拉乌头胺、松果林、附子宁、乌头原碱) 具有升高趋势,但组间差异并不明显,见图3。由此推测大个头附子可能具有高效低毒的性能,而小个头附子可能不仅低效,还具有大毒的药性。因此,初步判定附子质量分级具有一定的合理性。2.1.6 聚类分析 采用HemI 分析软件对5 种等级附子的含有量测定结果进行系统聚类分析,结果见图4。根据14 种生物碱含有量的差异,5 种等级的附子可被分为0 ~60 g 和60 ~100 g 两类,其中0~60 g 又被分为0 ~40 g 和40 ~60 g 两类。因此“小个头” 附子与“大个头” 附子中生物碱含有量是有明显差异的,并且同一等级附子组内差异小,证明了分级的科学性。另外,由热图颜色差异可知,新乌头碱、次乌头碱、附子宁、尼奥林、松果林的含有量高于其他生物碱,并且随着附子等级的升高,大毒成分新乌头碱和印乌头碱的含有量显著降低,镇痛成分尼奥林和松果林的含有量明显升高,进一步认为“小个头” 附子具有毒性强、镇痛功效弱的性能。
2.2 不同等级附子镇痛实验[14-15]
2.2.1 样品制备 取5 个不同等级的附子各10 g,提取2 次,第1 次加10 倍量水,浸泡30 min 后,煎煮3 h;第2 次加8 倍量水,煎煮3 h,合并提取液,浓缩至质量浓度0.5 g 生药/mL。取阿司匹林肠溶片适量, 研细, 用0.5% CMC-Na 配制成200 mg/kg 阿司匹林混悬液,作为镇痛阳性药。
图4 各成分在不同等级附子中的平均丰度热图Fig.4 Thermograph of average abundance for various constituents in different grades of Aconite
2.2.2 对小鼠醋酸所致扭体反应的影响 取小鼠56 只,雌雄各半,随机分为7 组,每组8 只。阳性对照组给予200 mg/kg 阿司匹林混悬液,空白组给予蒸馏水10 mL/kg,附子不同等级组均按5 g 生药/kg 灌胃给药,1 次/d,连续3 d。于末次给药后1 h, 给予各组小鼠腹腔注射0.6% 冰醋酸10 mL/kg,立即计时,记录小鼠首次出现扭体反应的时间作为潜伏期,同时记录每只小鼠造模后15 min 内出现的扭体次数,结果见表4。可知,与空白组相比,阳性组与附子组对小鼠醋酸所致扭体反应的影响存在显著差异,并且阳性组疗效优于附子各组。但是,附子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组扭体次数无组间差异,其疗效无显著差别。另外,阳性组相比于空白组显著增大了小鼠扭体潜伏期,附子组无显著性影响,而随着附子等级的升高,存在降低趋势,表明“小个头” 附子可能具有延长小鼠扭体潜伏期的效果。
2.3 不同等级附子最小致死量的测定[16-17]
2.3.1 样品制备 取不同等级附子粉末2 g,精密称定, 用20 mL 70%乙醇超声提取30 min。在5 000 r/min的条件下离心10 min,分离上清液。取1 mL 上清液, 加入19 mL 生理盐水稀释, 经0.22 μm微孔膜过滤,得测试溶液。精密称定乌头碱对照品适量, 溶解在无水乙醇中, 配成200 μg/mL溶液,在测定当天用生理盐水稀释配成10 μg/mL 标准溶液。
表4 不同等级附子对小鼠醋酸所致扭体反应的影响n=8)Tab.4 Effects of Aconite with different grades on writhingresponse caused by acetic acid in mice
表4 不同等级附子对小鼠醋酸所致扭体反应的影响n=8)Tab.4 Effects of Aconite with different grades on writhingresponse caused by acetic acid in mice
注:与空白组比较,∗P<0.01
阳性组组别 7潜.7伏2±期3./7m2i∗n扭3.体50次±2数.5/6次∗附子Ⅰ组 5.24±0.98 15.00±3.89∗附子Ⅱ组 4.96±1.02 13.38±3.93∗附子Ⅲ组 4.58±1.00 12.62±6.21∗附子Ⅳ组 4.46±1.27 14.38±5.01∗附子Ⅴ组 4.27±0.73 12.00±4.50∗空白组 3.89±0.60 26.12±3.94
2.3.2 对大鼠最小致死量测定 取大鼠36 只,随机分为6 组,每组6 只。实验时,将每只动物固定,并将标准溶液或测试溶液通过缓慢推注入大鼠尾静脉中,确保药物作用迅速,直到动物死亡。以瞳孔扩张和呼吸停止视为死亡的临界点,记录推注量(V) 和体质量(m),并根据药物浓度(c),由公式1 计算最小致死剂量(MLD),结果见表4。
此实验以MLD 越小,代表毒性越大。见图5,与乌头碱组相比,附子组MLD 显著升高,毒性降低。附子Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组MLD 高于附子Ⅰ、Ⅱ组,即毒性小于Ⅰ、Ⅱ组。另外,附子Ⅲ和Ⅴ组与其他3 组比较具有显著性差异,其MLD 升高,表现出低毒,而附子Ⅲ组MLD 最高,可能与其毒性成分含有量低有关。并且发现随着附子等级的升高,MLD 具有升高趋势,毒性存在降低趋势,但组间差异并不明显。因此,附子等级的差异与毒性在一定程度上具有相关性,进一步证明了分级的合理性。
3 讨论
图5 不同等级附子对大鼠最小致死量的测定结果(n=6)Fig.5 Results of determination of the MLD in rats with different grades of Aconite(n=6)
本研究以化学分析为基础,探讨不同等级附子间的毒效关系,并以药效与毒性实验验证附子分级的合理性。通过化学分析,14 种生物碱在不同等级附子中含有量存在显著差异,而这种差异主要与生物碱在皮部、髓部的分布差异和累积规律有关[10]。附子的长大增重主要是形成层内的髓部比例增大,而形成层外的皮部与韧皮部比例相对降低。再结合新乌头碱、次乌头碱在皮部、髓部的含有量可知,双酯型生物碱主要分布在形成层外的皮部与韧皮部,其含有量约为髓部的2 倍[2]。由此可知,大个头附子中双酯型生物碱含有量较低,主要是由髓部比例高,毒性成分含有量低决定的。并且随着附子等级的升高,呈现出双酯型生物碱降低的趋势。而在测定最小致死量的实验中, “大个头”附子具有较高MLD,呈现出低毒药性,两组实验结果相互验证, 表明 “小个头” 附子毒性强于“大个头” 附子。
附子的镇痛疗效显著,以镇痛效果验证附子分级的药效研究具有代表性[18-20]。在对小鼠醋酸所致的扭体次数的影响研究中,附子水煎液与阿司匹林均具有显著疗效。然而,5 个等级附子的镇痛效果在醋酸扭体实验中并未呈现出显著差异,可能是其生物碱含有量较高,均大于附子镇痛活性的最高有效剂量,因此,不同等级附子间生物碱存在的差异难以通过镇痛活性反映出来。根据化学分析结果,双酯型生物碱在小个头附子中含有量最高,又是镇痛作用的主要成分,因此,随着附子等级的升高,小鼠扭体潜伏期存在缩短的趋势。
综上,根据传统经验,将附子按照个头大小分档,具有一定的合理性。不同等级附子品质差异主要体现在毒性差异,而在镇痛活性上差异并不明显。因此,在充分保障附子减毒效果的前提下,可以考虑将小个头附子加工成炮制品用于临床,这有利于节约资源,提高药材利用率。