HPLC 法同时测定淫羊藿-骨碎补药对中7 种成分

洪雅丹， 张凌风， 潘娉娉， 骆 媱， 章建华， 尹 华∗

（1.浙江中医药大学药学院中药标准化研究实验室，浙江 杭州311402；2. 浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州310006）

淫羊藿、骨碎补为临床常用的补肾、活血中药，中医药传统理论认为肾藏精，主骨；骨痛筋挛，血脉凝涩，临床和实验研究常用来配伍治疗［1-3］。淫羊藿属补阳药，以补肾阳，强筋骨见长；骨碎补属活血药，以活血疗伤止痛、补肾强骨见长，两者配伍，既补肾强骨，又活血止痛［4-7］。现有文献中，尚未报道有关淫羊藿-骨碎补药对的多成分含有量测定。本研究首次建立HPLC 法同时测定淫羊藿-骨碎补药对中朝藿定A、新北美圣草苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的含有量，可用于其质量控制；结合配伍对7 种成分溶出的影响，为淫羊藿-骨碎补药对的配伍机制、配伍对其药效作用的影响等后续研究奠定基础。

1 材料

Waters e2695-2998 高效液相色谱仪 （美国Waters公司）；XS105DU 电子天平（十万分之一，瑞士Mettler 集团）；BS110S 电子天平（万分之一，德国Sartorious 集团）；Centrifuge 5804R 冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；PHS-3TC 精密数显酸度计（上海天达仪器有限公司）；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

淫羊藿饮片分别购于慈溪附海镇卫生院（批号1703015）、 浙江天道医药有限公司 （批号170501）、 浙 江 中 医 药 大 学 名 中 医 馆 （批 号171126）；骨碎补饮片分别购于浙江天道医药有限公司（批号170401）、慈溪附海镇卫生院（批号161227）、富阳骨伤医院（批号1607056），经浙江中医药大学药学院张如松教授鉴定为正品；淫羊藿为甘肃小檗科植物柔毛淫羊藿，骨碎补为广西水龙骨科植物槲蕨，符合2015 年版《中国药典》 （一部） 项下规定。柚皮苷（批号110722-200309） 对照品购自中国食品药品检定研究院；淫羊藿苷（含有量＞98%， B21576）、 朝藿定A （含有量＞98%，批号AYY90228） 对照品购自上海源叶生物科技有限公司；朝藿定B （含有量＞98%，批号MUST-17071403）、朝藿定C（含有量＞98%，批号MUST-17080705）、宝藿苷Ⅰ（含有量＞98%，批号MUST-17042203） 对照品购自成都曼斯特生物科技有限公司；新北美圣草苷（含有量＞98%，批号CHB171221） 对照品购自成都克洛玛生物科技有限公司。 甲醇、 乙腈均为色谱纯 （德国Merck 公司）；水为纯净水（杭州娃哈哈集团）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液制备 分别取朝藿定A、新北美圣草苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，精密称定，加甲醇配成质量 浓 度 分 别 为1.997、 2.829、 2.374、 2.199、2.029、2.268、1.925 mg／mL 的对照品贮备液。再分别精密吸取朝藿定A 10 μL、朝藿定B 11 μL、朝藿定C 13 μL、淫羊藿苷31 μL、宝藿苷Ⅰ7 μL、新北美圣草苷47 μL、柚皮苷71 μL 于1 mL 棕量瓶中，定容，摇匀，配制成含朝藿定A 19.97 μg、朝藿定B 24.20 μg、朝藿定C 26.37 μg、淫羊藿苷71.23 μg、 宝藿苷Ⅰ13.61 μg、 新北美圣草苷133.0 μg、柚皮苷169.0 μg 的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取淫羊藿（50 目）、骨碎补（40 目） 饮片粉末各0.2 g，精密称定，加60%乙醇20 mL，称定质量，90 ℃水浴回流45 min，冷却至室温，溶剂补足减失质量，续滤液于4 ℃、12 000 r／min离心15 min，取上清液，即得。

2.1.3 对照溶液制备 分别取淫羊藿（50 目）、骨碎补（40 目） 饮片粉末，按“2.1.2” 项下方法制成淫羊藿、骨碎补单药对照溶液。

2.2 色谱条件 Waters X Bridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈 （A） -0.1%磷酸 （B） 体系， 梯度洗脱 （0 ～13 min，17%A；13 ～14 min，17%～19%A；14 ～21 min，19%A；21 ～22 min，19%～23%A；22 ～48 min，23%A；48 ～49 min，23%～44%A；49 ～60 min，44%A；60 ～62 min，44%～90%A）； 体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；波长280 nm；进样量10 μL。上述色谱条件下，各检测成分均达到基线分离，理论塔板数均大于2 000。

2.3 专属性试验 取混合对照品溶液、淫羊藿-骨碎补药对供试品溶液及淫羊藿对照液和骨碎补对照液，在“2.2” 项条件下进样，得相应色谱图，见图1。在与7 个对照品相应的位置上，淫羊藿-骨碎补药对供试品均有相同保留时间的色谱峰；骨碎补对照样品无朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ色谱峰；淫羊藿对照样品无新北美圣草苷、柚皮苷色谱峰。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 精密吸取朝藿定A、新北美圣草苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ各对照品贮备液适量于2 mL 棕量瓶中，加甲醇定容， 摇匀， 制备质量浓度分别为88.46、 293.9、 432.0、 122.5、 124.6、 258.9、36.08 μg／mL 的混合对照品溶液，加甲醇稀释成6个质量浓度的对照品溶液，在“2.2” 项条件下分别进样10 μL，以各成分质量浓度为横坐标（X），对应峰面积为纵坐标（Y），进行回归，见表1。表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 取“2.1.1” 项混合对照液，在“2.2” 项色谱条件下连续重复进样6 次，测得朝藿定A、新北美圣草苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ峰面积RSD 分别为0.63%、0.13%、0.15%、0.25%、0.47%、0.35%、0.39%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取淫羊藿-骨碎补供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下， 分别于0、2、4、8、12、24、48 h 进样，测得朝藿定A、新北美圣草苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ峰面积RSD 分别为0.91%、0.32%、0.59%、0.91%、0.95%、0.37%、0.72%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 平行取淫羊藿（170501）、骨碎补（170401） 饮片粉末各6 份，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下以外标两点法进样，得朝藿定A、新北美圣草苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ平 均 含 有 量 分 别 为 3.282、 15.20、 11.63、4.183、3.620、10.17、1.397 mg／g，含有量RSD分 别 为 1.3%、 1.6%、 2.0%、 1.8%、 1.1%、1.7%、1.1%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取已测含有量的淫羊藿（170501）、骨碎补（170401） 饮片6 份，每份各约0.1 g，精密加入等同于样品含有量的各对照品贮备液，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.9 样品含有量测定 取3 批淫羊藿、骨碎补饮片，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，以外标两点法计算样品中7 种成分含有量，结果见表3。采用SPSS 17.0 统计软件分析，发现配伍后各成分含有量变化趋势不明显（P＞0.05）。

表3 各成分含有量测定结果（mg／g，n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g，n=3）

3 讨论

3.1 指标成分确定 2015 年版《中国药典》［5］将淫羊藿苷作为淫羊藿药材的指标成分，又将淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ作为饮片的指标成分，但朝藿定A、B、C 等黄酮类成分，也具有增加骨密度、促进成骨细胞分化、抗骨质疏松等作用，常作为含有量测定指标［8-9］。 《中国药典》 以柚皮苷作为骨碎补药材指标成分，但其所含的新北美圣草苷也可增强成骨细胞活性、减少破骨细胞形成，具有较强生理活性［10-13］。因此，本研究选择该7 种成分作为淫羊藿-骨碎补药对的质量分析指标。

3.2 色谱条件优化 本研究以7 种成分色谱峰的分离度、分析时间及峰形为评价指标，考察了流动相体系（甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水） 和柱温（20、25、30 ℃），结果确定为25 ℃、乙腈-0.1%磷酸水。 采用DAD 检测器在200 ～400 nm进行光谱扫描，得相应图谱，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ最大吸收波长为270 nm，新北美圣草苷、柚皮苷最大吸收波长283 nm。表明280 nm 波长下，7 种成分均有较好的灵敏度，杂峰干扰较小，故确定其为检测波长。

3.3 处理方法选择 本研究考察了不同提取方法（回流、超声）、溶剂［45%、60%、75%甲醇（乙醇） 溶液］、提取时间 （30、45、60 min） 等条件，结果表明60%乙醇回流提取45 min。比较不同溶剂倍量对各成分含有量的影响，表明以100 倍溶剂提取时，各成分提取完全且含有量稳定。最终确定了淫羊藿-骨碎补药对的供试品溶液前处理工艺。

本研究首次建立了HPLC 法同时测定淫羊藿-骨碎补药对中7 种成分的含有量，结果准确可靠，可用于淫羊藿-骨碎补药对及其相关制剂的质量控制与评价。淫羊藿-骨碎补各成分含有量配伍前后没有明显变化，配伍对淫羊藿-骨碎补活性成分的溶出无明显影响。结合配伍后各成分含有量的变化趋势，为淫羊藿-骨碎补药对配伍对化学成分溶出、对药效的影响以及配伍机制等后续研究奠定基础。