穿破石总黄酮抗氧化性的研究

许丹妮　梁云贞　韦方立

摘要：为了探讨穿破石（Radix Cudramiae）总黄酮抗氧化活性，采用不同方法（Fenton法、邻苯三酚自氧化法和DPPH法）测定了穿破石总黄酮的抗氧化活性，以维生素C为阳性对照。结果表明，穿破石总黄酮清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的能力比维生素C强，其EC50分别为2.33、2.15、0.27 μg/mL，维生素C清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的EC50分别为12.88、7.76、11.23 μg/mL。

关键词：穿破石（Radix Cudramiae）;总黄酮;抗氧化性

中图分类号：Q949.737.4         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）11-0093-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.11.022           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Antioxidant activity of total flavonoids from Radix Cudraniae

XU Dan-ni，LIANG Yun-zhen，WEI Fang-li

（Guangxi Normal University of Nationalities，Chongzuo 532200，Guangxi，China）

Abstract： In order to study the antioxidant activity of total flavonoids from Radix Cudraniae， taking vitamin C as positive control， the antioxidant activity of total flavones from Radix Cudraniae was determined by different methods， including Fenton reaction， self-oxidation of 1， 2， 3-phentriolassay method and DPPH radical-scavengings. The results show that the flavonoids from Radix Cudraniae have very strong scavenging capabilities for hydroxyl radical， superoxide anion and DPPH free radical， their EC50 values are 2.33， 2.15 and 0.27 μg/mL， respectively， and the EC50 of vitamin C scavenging capabilities for hydroxyl radical， superoxide anion and DPPH free radical are 12.88， 7.76 and 11.23 μg/mL， respectively.

Key words： Radix Cudramiae; total flavonoids; antioxidation

黃酮类化合物是一类广泛分布在植物界中、具有多种生物活性的多酚类化合物。大量研究表明，植物中提取的黄酮类化合物具有抗心脑血管疾病、抗氧化、抗衰老、镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等多种功效，在医药领域具有广阔的应用前景[1，2]。近年来，对黄酮的抗氧化性研究备受关注，从自然界开发更多的天然黄酮类化合物已成为研究热点。

穿破石（Radix Cudramiae）为桑科植物柘树[Cudrania tricuspidata （Carr.） Bur. ex Lavallee]的根，全年可采，洗净切片晒干，以根（黄色）入药。生于山坡，溪边、灌丛中，分布于湖南、浙江、安徽、福建、广东、广西等地。相关医药书籍的记载：《岭南采药录》：“祛风湿，十蒸九晒; 治跌打，酒煎服; 肩疮和蜜捣敷。”《南宁市药物志》：“血通经，治淋浊，去远年瘀积、结石。”《广西实用中草药新选》：“清热活血，止咳祛痰，治劳伤咳血。”现代研究文献报道，穿破石具有祛风利湿、活血通经等功效，能治疗风湿关节疼痛、黄疸、淋浊、蛊胀、闭经、劳伤咳血、跌打损伤及疔疮痈肿等病症，是目前民间常用本草中药，极具开发利用价值[3-5]。目前鲜见有关穿破石根总黄酮的抗氧化活性的研究报道，为此，本研究对穿破石根总黄酮进行提取，采用3种目前较为成熟的检测方法对其体外抗自由基活性进行检测，确定其抗氧化功能，以期为更好地开发和利用穿破石资源，开发新的安全的天然抗氧化剂提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  穿破石原材料  穿破石采自广西龙州县彬桥乡小青山，经广西民族师范学院食品与生物工程学院植物学科黄秋蝉教授和梁云贞副教授鉴定为桑科植物柘树的根。

1.1.2  试剂  芦丁标准品（购自Bioszune.Inc.，纯度≥98%）、邻二氮菲、1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）（CAS：1898-66-4，上海晶品纯试剂有限公司）、邻苯三酚、无水乙醇、双氧水、抗坏血酸（维生素C）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸95%、乙醇。

1.1.3  主要仪器、设备  UV-1601型紫外可见分光光度计（北京瑞利仪器有限公司）、KJ23B-AN型美的微波炉（广东美的微波炉制造有限公司）、FW800型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）、AR124CN型电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]、PHS-3C型实验室pH计（上海今迈仪器仪表有限公司）、DKS-12型不锈钢新型电热恒温水浴锅（杭州蓝天化验仪器厂）、SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2  方法

1.2.1  穿破石总黄酮的提取  穿破石→清洗→烘干（60 ℃）→粉碎、过60目筛（贮藏于干燥箱中备用）→称重→热乙醇浸提→微波处理→抽滤→收集滤液→4 ℃冷藏备用。

1.2.2  穿破石总黄酮含量的测定

1）芦丁标准曲线的绘制。称取芦丁对照品25.0 mg，置于100 mL容量瓶中加80%乙醇溶解，定容。吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL芦丁溶液分别置于50 mL容量瓶中加5%亚硝酸钠1.5 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝1.5 mL混匀，放置6 min，加4% NaOH 20 mL，再加80%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以80%乙醇为空白对照，在510 nm下测定吸光度，绘制芦丁的标准曲线。

2）穿破石总黄酮含量的测定。取“1.2.1”所得穿破石黄酮提取液1 mL于50 mL容量瓶中，按“1.2.2”中的NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法进行操作，于510 nm处测定吸光度，根据芦丁标准曲线计算样品总黄酮的含量。

1.2.3  穿破石总黄酮抗氧化活性的测定

1）对·OH清除活性的测定。采用Fenton反应进行测定，参考文献[6]和[7]的方法并做适当修改。每管以0.5 mL邻二氮菲（7.5 mmol/L）与0.5 mL磷酸盐缓冲溶液（0.75 mmol/L，pH 7.4）和0.5 mL NH4Fe（SO4）2（7.5 mmol/L）溶液混匀，再加入0.5 mL 0.1%的H2O2溶液，以H2O代替H2O2为未损伤管，样品管加入1.0 mL不同浓度穿破石总黄酮提取液，未损伤管与损伤管以H2O代替，混匀后置于37 ℃水浴60 min，536 nm处测定吸光度。用一定浓度梯度的维生素C溶液作为阳性对照，根据以下公式计算·OH清除率。

清除率=[（A 样品-A 损伤）/（A 未损伤-A 损伤）]×100%

式中，A 样品为样品管吸光度，A 未损伤为未损伤管吸光度，A 损伤为损伤管吸光度。

2）对超氧阴离子自由基（O2-·）清除作用的测定。采用邻体三酚自氧化方法进行测定，参考文献[8]的方法并做适当修改。取3.5 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.2）加入1.0 mL不同浓度的样品溶液混匀，于25 ℃水浴20 min后加入0.5 mL邻苯三酚溶液（50 mmol/L，用10 mmol/L HCl配制，25 ℃水浴20 min預热），混匀于25 ℃水浴反应4 min（自加入邻苯三酚开始计算时间）即加入3滴8 mol/L HCl终止反应。于325 nm处测吸光度（A 样品）。用超纯水代替样品测空白管吸光度（A），对照管用10 mmol/L HCl溶液代替邻苯三酚溶液，测吸光度（A 对照）。用一定浓度梯度的维生素C溶液作为阳性对照，以下列公式计算O2-·清除率。

清除率=[1-（A 样品-A 对照）/（A-A 对照）]×100%

式中，A 样品为样品管吸光度，A 为空白管吸光度，A 对照为对照管吸光度。

3）对DPPH清除活性的测定。参照文献[9]和[10]的方法并做改进。精确称取39.4 mg DPPH，加入95%的乙醇溶解并定容至500 mL，配制成0.2 mmol/L DPPH溶液，置于4 ℃冰箱冷藏备用。使用前将其稀释成0.1 mmol/L。样品管中加入1.0 mL不同浓度的样品溶液和4.0 mL DPPH溶液，以95%乙醇代替DPPH溶液作为对照，以超纯水代替样品作空白对照，以上3组置于30 ℃水浴（避光）30 min后，用超纯水调零于517 nm处测吸光度。用一定浓度梯度的维生素C作为阳性对照，用以下公式计算对样品溶液DPPH的清除率。

清除率=[1-（A 样品-A 对照）/（A-A 对照）]×100%

式中，A 样品为样品管吸光度，A 为空白管吸光度，A 对照为对照管吸光度。

2  结果与分析

2.1  穿破石总黄酮含量的测定

芦丁标准曲线的绘制和回归方程建立按“1.2.2”所示方法进行，可得回归方程：A=11.533C+0.008， 相关系数R2为0.999 8，其线性关系很好。取“1.2.1”所得穿破石根总黄酮提取液1 mL于50 mL容量瓶中， 按“1.2.2”项下NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法进行操作，于510 nm处测定吸光度，根据芦丁的回归方程计算样品总黄酮的含量。

2.2  穿破石总黄酮抗氧化活性

2.2.1  对·OH的清除活性  穿破石总黄酮和维生素C对·OH自由基的清除效果如图1所示。由图1可以看出，随着总黄酮浓度的增加，其清除·OH的能力逐步增强。在1.54～7.70 μg/mL范围内，穿破石总黄酮对·OH自由基有明显的清除作用，呈现明显的量效关系。根据回归方程计算，其清除率为50%的有效浓度EC50为2.33 μg/mL，而维生素C对·OH清除作用的EC50为12.88 μg/mL，说明穿破石总黄酮对·OH的清除作用强于维生素C。

2.2.2  对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除活性  穿破石总黄酮和维生素C对O2-·的清除效果如图2所示。由图2可以看出，随着总黄酮浓度的增加，其清除超氧阴离子自由基（O2-·）的能力逐步增强。在0.99～3.96 μg/mL范围内，穿破石总黄酮对超氧阴离子自由基（O2-·）有明显的清除作用，呈现明显的量效关系。根据回归方程计算，其清除率为50%的有效浓度EC50为2.15 μg/mL，而维生素C对超氧阴离子自由基（O2-·）清除作用的EC50为7.76 μg/mL，说明穿破石总黄酮对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除作用强于维生素C。

2.2.3  对DPPH的清除活性  穿破石总黄酮和维生素C对DPPH的清除效果如图3所示。由图3可以看出，随着总黄酮浓度的增加，其清除DPPH的能力逐步增强。在0.11～0.56 μg/mL范围内，穿破石总黄酮对DPPH自由基有明显的清除作用，呈现明显的量效关系。根据回归方程计算，其清除率为50%的有效浓度EC50为0.27 μg/mL，而维生素C对DPPH自由基清除作用的EC50为11.23 μg/mL，说明穿破石总黄酮对DPPH自由基的清除作用强于维生素C。

3  小结与讨论

穿破石是壮族人民常用的中草药，其中含有的黄酮类物质具有多种生物活性，梁云贞等[11]、许元明等[12]已经优化穿破石中黄酮的提取工艺，用紫外分光光度法测量穿破石提取液中黄酮的含量。另有黄秀香等[13]采用复合酶辅助超声提取穿破石中黄酮苷进行工艺优化。在药理方面，金俊杰等[14-16]研究表明，穿破石水提取物和醇提取物对急性肝损伤、肝纤维化有一定的保护和治疗作用，在急性毒性实验研究方面也表明穿破石水提取物和醇提取物无急性毒性。以上的研究说明穿破石具有较高的药用价值，为了进一步开发利用穿破石资源，探讨其抗氧化活性，该研究从穿破石中提取总黄酮，并对其抗氧化性进行研究。

自由基可以與细胞内 DNA、蛋白质和多元不饱和脂肪酸（PUFA）发生作用，造成DNA链断裂和氧化性损伤、蛋白—蛋白交联、蛋白—DNA交联和脂质过氧化，引起机体的细胞和组织损害，影响功能，引发各种病变，因此清除自由基对抗氧化具有重要的意义。试验结果表明，穿破石总黄酮清除羟自由基、超氧负离子自由基和DPPH自由基的能力比维生素C强，穿破石总黄酮除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的EC50分别为2.33、2.15、0.27 μg/mL，维生素C清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的EC50分别为12.88、7.76、11.23 μg/mL。因此穿破石总黄酮具有良好的抗氧化能力，是一种天然有效的自由基清除剂，本研究结果可为穿破石作为植物资源药物的进一步研究和开发提供理论依据。

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