江苏省猪伪狂犬病流行病学调查及两种疫苗免疫效果评估

佘志成，李 群，王 凯，郎秀艳，宋庆庆*

（1.金宇保灵生物药品有限公司，内蒙古 呼和浩特 010030；2.扬州优邦生物药品有限公司，江苏 扬州 225008）

伪狂犬病是一种由伪狂犬病毒感染引起的多种家畜和野生动物共患的急性、热性传染病，除猪以外的其他动物均呈致死性感染，猪是伪狂犬病毒的唯一自然宿主。我国于20世纪70年代由哈尔滨兽医研究所从匈牙利引进了伪狂犬疫苗Bartha-k61株，自20世纪90年代以来国内规模化猪场普遍使用该基因缺失疫苗，使猪伪狂犬病得到了很好的控制。但是2011年以后，一种由伪狂犬病毒变异毒株引起的猪伪狂犬病在我国暴发，造成大量母猪繁殖障碍、100%初生乳猪死亡率以及育肥猪严重的呼吸道问题，给我国养猪业造成了巨大的经济损[1-3]。

本实验通过间接 ELISA 方法检测猪群中的 gE 抗体来鉴定猪群是否被伪狂犬病野毒感染，对猪伪狂犬病gE阴性场检测 gB 抗体来判定猪群的猪伪狂犬病抗体保护水平，由此系统调查分析江苏地区猪伪狂犬病的流行情况，并在一存栏1 000头左右经产母猪的猪伪狂犬病阳性猪场尝试使用最新上市的变异株活疫苗与抗原含量最高的进口产品相比控制猪伪狂犬病效果，通过检测猪伪狂犬病gE，gB抗体及中和抗体评估伪狂犬病的控制效果，为进一步开展猪伪狂犬病的综合防治以及猪伪狂犬病净化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

被检血清样品共4 608份，从2017年5月至2019年1月采集自江苏地区59个规模化猪场，其中种猪群1 521份样品、仔猪群1 901份样品、育肥猪群896份样品，后备猪群290份样品分别检测猪伪狂犬病gE、gB抗体。

1.2 试剂及仪器

猪伪狂犬病gE抗体ELISA试剂盒（西班牙Hipra）和猪伪狂犬病gB抗体检测试剂盒（荷兰BioChek）均购自北京天之泰生物科技有限公司；Eppendorf 移液器、酶标仪、生化培养箱、洗板机、TGL-16G 高速台式离心机、二氧化碳培养箱、涡旋振荡器；伪狂犬病变异毒株YB-1、伪狂犬病经典毒株HB-G株，ST细胞由扬州优邦生物药品有限公司保存。两种疫苗均为商品化疫苗，A 组疫苗为进口产品，毒株为 Barth-K61 株，批号L447801；B 组疫苗为国内分离双基因缺失株C株，江苏某公司生产，批号17251001。

1.3 疫苗免疫

疫苗免疫实验自2018年7月至2019年1月，在江苏地区一存栏1 000头左右母猪场进行，该场在本次流行病学调查中判断为猪伪狂犬病阳性活跃场，实验分A、B组进行，免疫程序为新生仔猪滴鼻1头份，10周龄、14周龄、18周龄肌肉注射1头份；首次肌肉注射时A组408头，B组435头。

1.4 ELISA及中和抗体检测

两实验组分别在4周龄、6周龄、10周龄、14周龄、18周龄、20周龄、24周龄采血，分离血清ELISA检测两组gE、gB抗体，检测两组14周龄、18周龄血清测中和抗体。

1.5 测定伪狂犬病毒效价（TCID50）

ST细胞培养至单层后，弃去细胞培养液；将收获病毒样品用DMEM无血清培养基按照10倍稀释度连续倍比稀释到10-9，将不同稀释度的毒液加入96孔细胞培养板中，每个浓度做8个重复孔，每孔100 μL，吸附1 h后，加入维持液；培养96 h后，观察细胞病变（CPE），记录每个稀释度的CPE数量，按照Reed-muench方法计算TCID50。

1.6 中和抗体测定

病毒液稀释至200 TCID50备用；取1新的96孔细胞培养板作为稀释板，A1-G1孔加入200 μL血清样品（血清稀释度1:2），其余每孔加入100 μL DMEM液，从A1孔取100 μL毒液至A2孔混匀后，再向A3孔加入100 μL混合液，按照上述方法依次倍比稀释至第10孔，剩余两孔设为病毒对照孔和阴性对照孔，将各血清稀释孔和病毒对照孔加入 100 μL 200 TCID50病毒液，阴性对照孔则加入100 μL DMEM液，37 °C孵育1 h后；将铺有ST细胞的96孔板，弃去细胞液，将稀释板上液体转移至细胞板，培养96 h后观察CPE，以最高稀释度CPE作为中和抗体效价。另做回归实验，将病毒做1、10、100、1 000倍的稀释，将稀释后的病毒液加入细胞板中，每孔100 μL，每个稀释度做6个重复孔，另外设6个对照孔，只加入DMEM，若100倍稀释毒孔有半数出现CPE，则实验成立。

2 结果

2.1 猪伪狂犬病 gE 抗体检测情况

2017年5月份至2019年1月份从江苏地区59个规模场进行采样检测，抽检了4 608份样品，gE抗体阳性样品数1 681份，总体阳性率达到36%，进一步分析母猪群1 396份样品中有642份阳性，公猪125份样品中gE抗体阳性62份，种猪群的阳性率近50%，大于120日龄的育肥猪群样品896份，其中gE阳性252份，gE阳性率达28%（见表1），提示江苏地区猪伪狂犬病感染较严重，种猪群感染率高于商品猪群，这些猪场均是进行猪伪狂犬病疫苗免疫的猪场，但未能很好地控制伪狂犬病毒的感染。

根据《猪病学》第9版，猪伪狂犬病母源抗体持续期为4个月，由于母猪一旦感染终生带毒，母猪及仔猪的gE抗体并不能完全代表猪场伪狂犬病毒的感染情况，为准确评估猪场伪狂犬病的控制效果，我们进一步对各个猪场商品猪的gE抗体也进行分析，发现对于每个猪场根据母猪群gE阳性与否以及商品猪阳性与否的情况对猪场伪狂犬病感染情况进行细分，发现猪场母猪及商品猪均阳性的场比例达37%（见表2）。另对本地区8个猪伪狂犬病gE阴性场的gB抗体情况进行检测分析，总体gB阳性率为74%，其中主要问题在于育肥猪阶段合格率偏低只有62%（见表3），是主要的免疫漏洞所在。

2.2 猪伪狂犬病防控实验前免疫程序调整

在猪伪狂犬病流行病学调查中，与江苏一规模猪场场主进行沟通，其表现强烈地控制本场猪伪狂犬病问题的想法，基于此，制定了该场的猪伪狂犬病防控方案，该场之前使用国产HB2000株猪伪狂犬病疫苗未能很好解决场内猪伪狂犬病问题，检测母猪群阳性率gE抗体阳性率95%，商品猪伪狂犬病gE阳性率100%（见表4），实验前进行了一次母源抗体调查（见表5），对猪伪狂犬病免疫程序调整为出生24 h内滴鼻，10周龄、14周龄、18周龄3次肌肉注射。

2.3 猪伪狂犬病防控实验结果评估

该实验于2018年7月26日开始，实验两组分别接种A疫苗与B疫苗于4周龄、6周龄、10周龄、14周龄、18周龄、20周龄、24周龄采血，最后一次采血为2019年1月15日，所采血样分别检测gE、gB抗体，两组在18周龄后gE抗体均为阴性，表明仔猪4～14周龄gE抗体阳性均为母源抗体持续，非感染产生，且18周龄后gB抗体阳性率均为100%（见表6），此时的gB抗体为疫苗免疫产生，提示疫苗均产生了较好的保护，相比之前猪伪狂犬病得到了较好的控制。

2.4 中和抗体检测结果

中和抗体是评判猪伪狂犬病疫苗免疫效果的金标准，但是检测中和抗体费时费力，不适合大批量检测，本实验选取首免后4周，二免后4周测中和抗体，比较两组差异，检测结果表明二免后4周B组无论是对变异株还是经典株，中和抗体均优于A组（见表7）。

表1 江苏地区猪伪狂犬病 gE 抗体检测情况

表2 江苏地区猪场伪狂犬病gE阳性比例

表3 江苏地区8个猪伪狂犬病毒gE阴性猪场的gB抗体情况

3 讨论

随着变异株猪伪狂犬病毒的出现，传统疫苗的保护效率在下降，全国各地流行病学调查均发现自2011年以后猪群中猪伪狂犬病毒gE抗体的比例明显上升，同时各地均分离到猪伪狂犬病毒变异毒株[4-9]。对江苏地区规模化猪场gE抗体调查发现，样品总体gE阳性率达36%，其中种猪群的gE阳性率达到50%，相比全国平均水平，江苏地区猪伪狂犬病感染压力较大。猪只一旦感染伪狂犬病病毒可终生带毒，而仔猪母源抗体半衰期为18 d，母源抗体最长持续期可达4个月，因此对于母猪群已经是gE阳性的父母代猪场，如何有效防控和正确的评估伪狂犬病的防控效果尤为重要，必须要检测120日龄以后商品猪群的伪狂犬病gE抗体情况。本次调查也对各猪场育肥猪群gE抗体情况进行了解，育肥猪群gE抗体阳性占总育肥猪群的比例达到28%，育肥后期猪群gE抗体阳性的猪场占比达到37%，江苏地区的猪场血清调查揭示即使免疫了猪伪狂犬病疫苗，育肥猪群的防控效果仍不容乐观。

表4 实验前猪伪狂犬病血清样品gE、gB抗体调查

表5 猪伪狂犬病母源抗体检测

表6 注射两种疫苗后产生gE、gB抗体比较

表7 中和抗体检测

在gE抗体阴性的情况下，gB 免疫抗体阳性率与其中和抗体效价有一定的相关性，gB–ELISA 抗体水平可以用来评估生猪对当前流行 PRV 毒株的相对免疫保护力[9-10]，在江苏8个gE阴性的猪场我们检测发现育肥猪阶段gB抗体阳性率62%，且S/P值相对较低，提示育肥阶段为猪伪狂犬病防控一大薄弱环节，需要引起重视。

猪伪狂犬病病毒C株是国内新近分离到的伪狂犬病毒变异株，同猪伪狂犬病病毒Bartha-k61同源性为95%～96%，与PRV Bartha-k61不属同一个毒株[11]。中和抗体检测是评估免疫效果的金标准，gB抗体只是中和抗体的一种，且一般认为中和抗体大于1:2时对应ELISA检测gB抗体水平即为阳性，ELISA检测的gB抗体S/P值与中和抗体有一定相关性，为更好地评估疫苗的猪场使用效果，在检测gB抗体的基础上可进一步进行中和抗体的检测。我们在一猪伪狂犬病阳性的猪场进行了两组疫苗的防控效果评价，两组在相同的免疫程序下育肥阶段18周龄以后至出栏前均保持gE抗体阴性，gB抗体阳性率100%，达到了较好的控制效果，进一步于首免后4周，二免后4周检测中和抗体发现B组在二免后无论是对经典株还是变异株的中和抗体效价均优于A组，差异显著。中和抗体效价越高，对病毒的中和效果越好，对于猪伪狂犬病阳性猪场，在充分了解猪群感染情况及母源抗体消减的情况下，选择优质的疫苗进行科学免疫能产生更高的中和抗体，取得较好的伪狂犬病控制效果为进一步净化猪伪狂犬病提供基础。