不同基材复配紫薯花青素制备智能指示膜及其应用

蒋光阳，肖力源，王章英，陈安均，吴贺君，张志清,*

（1.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014；2.广东省农业科学院作物研究所，广东 广州 510000 ）

食品智能包装是通过对食品包装的内部环境进行实时监视，获取食品在贮运期间品质安全信息的技术，根据功能的不同将其分为时间-温度指示型、气体泄露指示型和新鲜度指示型[1]。其中新鲜度指示型智能包装是利用食品在贮运过程中释放的一些特征气体与试剂产生特征颜色、温度反应等引起内部指示剂颜色变化，从而得到食品实时信息[2]。

许多天然聚合物，如淀粉、壳聚糖、果胶、琼脂等由于其低毒性、可降解性、相容性好等特点被广泛用作成膜基材[3-4]。然而智能指示膜的制备除了需要成膜基材外，主要还有指示剂的选择，有研究发现质量分数3%溴甲酚紫溶液、聚苯胺、溴百里酚蓝作为指示剂能及时传达出食品内部的实时信息[5-6]。但是，合成敏感材料具有毒性，用于包装食品对人体健康有一定危害；因此开发天然安全无毒的指示剂显得尤为重要。花青素属于水溶性天然色素，对人体无危害，主要结构为2-苯基苯并吡喃阳离子，其会随pH值的改变显示不同颜色，可满足膜中指示剂的要求。目前，天然色素作为智能指示膜的指示剂也成为了国内外研究的热点之一。桑葚花青素提取液、葡萄皮花青素提取液、蓝莓花青素提取液、玫瑰花青素提取液等在智能指示膜指示剂的应用中已取得一定的成果[7-8]。肉制品在贮藏过程中，蛋白质的分解会产生许多的挥发性物质，导致pH值上升，但新鲜度指示型智能包装可以及时反映肉制品的新鲜度。Chun等[9]将溴甲酚绿作为检测鲭鱼新鲜度的指示剂，观测鲭鱼鱼肉新鲜度的实时变化。Zhai Xiaodong等[10]将聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）和淀粉作为成膜基材加入玫瑰花青素制成指示膜，并用于鱼肉贮藏期间新鲜度的检测，随着鱼肉贮藏时间的延长，覆盖在鱼肉上的指示膜颜色由红色变为浅蓝色。Liu Bin等[11]的研究以PVA和淀粉作为成膜基材、紫薯花青素作为指示剂制备指示膜并实时监测牛奶新鲜度的变化。Choi等[12]以琼脂作为成膜基材、以紫薯花青素作为指示剂制备智能指示膜用于检测猪肉在25 ℃条件下新鲜度的变化，但琼脂的颜色对花青素颜色变化会有一定的影响。

本研究以可降解材料淀粉、羧甲基纤维素钠（carboxymethyl-cellulose sodium，CMC）、魔芋葡甘露聚糖（konjac glucomannan，KMG）两两互配为成膜基材，并加入天然紫薯花青素作为成膜指示剂，通过流延法制备指示膜。并比较不同基材指示膜间力学性能、水溶性、微观结构、相容性、颜色稳定性及显色效果，以期为紫薯花青素应用于智能指示膜提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫薯（‘广紫2号’，2017年11月收获），由广东省农业科学院作物所提供。新鲜活草鱼，购买于四川省雅安市农贸市场，每尾约1.2 kg。

马铃薯淀粉（水分质量分数17.52%、直链淀粉质量分数21.62%、脂肪质量分数0.025%、蛋白质量分数0.018%）宁夏万里淀粉有限公司；KGM 金阳泰兴农业有限责任公司；中速滤纸 美国沃特曼公司；CMC、丙三醇、无水乙醇（分析纯） 成都科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

RE-200B型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；Sartorius CP225D型电子天平 德国赛多利斯公司；UV-3100N紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅 江苏荣华仪器制造有限公司；TA.XT Plus质构仪 北京超技仪器有限公司；FJ200-SH数显恒速高速分散均质机 上海垒固仪器有限公司；148-121型螺旋测微器 郑州中天实验仪器有限公司；Ultra型扫描电子显微镜 德国卡尔-蔡司股份公司；Nicolet iS5傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪 美国热电公司；SC-10便携式色差仪 苏州欣美和仪器有限公司；玻璃成膜板（23 cm×28 cm）或有机成膜板为自制；EW-73B单反照相机 日本佳能公司。

1.3 方法

1.3.1 紫薯花青素提取

将紫薯于60 ℃干烘至恒质量，粉碎机打粉过60 目筛备用（紫薯粉水分质量分数6.75%）。称取一定量紫薯粉，按料液比1∶10（m/V）加入体积分数40%乙醇溶液（提取剂），60 ℃水浴搅拌3 h，滤纸抽滤两次收集滤液[12]。于50 ℃旋转蒸发（避光）得到花青素浓缩液，真空冷冻干燥48 h得到紫薯花青素粉。

1.3.2 紫薯花青素光谱特征

紫薯花青素在不同的pH值条件（pH 2～12）下，使用相机记录花青素溶液的颜色变化，并通过紫外-可见分光光度计进行可见光光谱扫描，波长范围在400～800 nm之间[12]。

1.3.3 智能指示膜的制备

取6 g马铃薯淀粉（starch，S）溶于100 mL蒸馏水中，95 ℃搅拌糊化15 min后备用；取0.6 g KGM溶于100 mL蒸馏水中备用；取1.2 g CMC溶于100 mL蒸馏水中备用[13]。将3 种制备好的溶液分别按照质量比1∶1进行两两混合，分别制备KCG/淀粉（KS）混合液、淀粉/CMC（SC）混合液、KCG/CMC（KC）混合液，在这3 种混合液中均依次加入质量分数1%丙三醇、质量分数0.2%紫薯花青素粉（P），10 000 r/min均质5 min，混合液经真空、超声除去气泡后倒入板中，45 ℃烘箱中烘干成膜，得到紫薯花青素膜，分别记为KSP、SCP、KCP。揭膜后置于相对湿度（55±1）%、温度（25±1）℃的恒温恒湿箱中平衡48 h后测定性能[14]。

1.3.4 智能指示膜的表征

1.3.4.1 膜厚度的测定

参照GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的测定 第3部分：薄膜和薄片的试验条件》[15]，采用电子数显千分尺测定，选取膜的对角和中心点进行测定，取平均值用于其他各项物理性能计算，单位为mm。

1.3.4.2 力学性能的测定

使用TA.XT Plus质构仪测定膜的抗拉强度和断裂伸长率，将膜裁剪为80 mm×15 mm的薄条，将初始距离设置为50 mm，测定速率为50 mm/min。每组样品测试8个平行样品，拉伸强度、断裂伸长率分别按照公式（1）、（2）进行计算。

式中：F表示膜断裂时承受的最大张力/N；b表示膜宽度/mm；d表示膜的厚度/mm；L表示膜断裂时的长度/mm，L0表示膜的初始长度/mm。

1.3.4.3 膜水分质量分数、水溶性测定

将坩锅放在105 ℃烘箱中烘至恒质量，称取质量为m1/g的膜放入恒质量坩锅，在105 ℃烘箱中烘至恒质量（m2/g），每组重复测定3 次[16]。水分质量分数按式（3）进行计算。

在室温下将在105 ℃烘箱中烘至恒质量（m1/g）的膜浸泡在50 mL蒸馏水中，24 h后倒出浸泡液，将其放入105 ℃烘箱中烘至恒质量（m2/g），每组重复测定3 次[16]。水溶性按式（4）进行计算。

1.3.4.4 膜颜色稳定性的测定

将3 种智能指示膜分别放置于温度4 ℃或25 ℃、相对湿度75%的恒温恒湿箱中2 周，每隔2 d利用色差仪对膜的色泽（L、a、b）进行测定，并按公式（5）计算色差（ΔE）[17]。

式中：L、a、b分别为膜放置后的测定值；L0、a0、b0为膜放置前初始测定值。

1.3.4.5 扫描电子显微镜分析

测定前将样品裁成2 cm×2 cm的试样，45 ℃干燥24 h，用液氮将智能膜冷冻断裂，真空溅射喷金，通过扫描电子显微镜观察3 种智能指示膜的横截面结构并拍照，加速电压为10 kV。

1.3.4.6 FTIR分析

将成膜材料和3 种智能指示膜在45 ℃干燥箱中烘至恒质量，利用FTIR仪测定样品的吸收光谱，扫描范围为650～4 000 cm-1。

1.3.4.7 鱼肉新鲜度检测的应用

将去皮后的鱼肉切成10 g/块并去刺备用，将综合性能较优的紫薯花青素膜裁成大小为3 cm×3 cm的小块并覆盖在鱼肉上一起放入培养皿中，用保鲜膜包裹并置于25 ℃的恒温恒湿条件下贮藏48 h。隔12 h测定膜的颜色（L、a、b值）变化，计算出ΔE，同时使用相机记录SCP膜颜色的变化；并根据GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》测定鱼肉的总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量[18]。

1.4 数据统计与分析

结果以平均值±标准差形式表示，使用SPSS 20软件进行数据处理，采用方差分析进行显著性差异分析，P＜0.05表示差异显著。采用Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 紫薯花青素溶液在不同pH值下的颜色及可见光谱

在不同pH值条件下，花青素会显示出不同的颜色。由图1a可知，当pH 2～12时，紫薯花青素的颜色随溶液pH值的升高呈现出由深红色→浅红色→紫色→蓝色→绿色→黄色。因为花青素在水溶液中不稳定，在特定的pH值环境中，黄烊盐离子、醌式碱、甲醇假碱以及查耳酮4 种结构之间存在平衡，但随着pH值的变化，各结构之间的转换易受到影响，从而导致花青素水溶液颜色发生变化（图1b）。当花青素在酸性介质中，红色的黄烊盐阳离子在介质中起主要作用，使得溶液呈现出红色。水化平衡转换是导致颜色变化的主要因素，花青素水溶液中黄烊盐阳离子经水化平衡后转变为共轭生色体被破坏的无色假碱，导致溶液中无色的甲醇假碱起主要作用，红色逐渐退去。随着pH值的不断上升，花青素失去原本C环O上的阳离子，从而变为蓝色醌式碱，导致原来黄烊盐离子浓度以及色泽强度同时发生下降，溶液逐渐呈现出蓝色。最后在强碱条件下花青素极不稳定而被降解，溶液变成黄色[19]。

图1 不同pH值条件下紫薯花青素溶液颜色及结构变化Fig. 1 Changes in structure and color of purple sweet potato anthocyanin solutions under different pH conditions

由图2a可知，当pH 2～5时，紫薯花青素颜色呈红色或浅红色，且随着溶液pH值增加，紫薯花青素的最大吸收峰的波长从524 nm向556 nm迁移，吸光度也明显下降。当花青素溶液的pH值升到7时，最大吸收波长增加到556 nm附近。当pH 8～12时，最大吸收光谱处于604 nm附近。

一般情况下，波长处于400～800 nm范围内时，不同pH值的花青素吸光度能及时反映其互补颜色的色度，比如花青素在400～800 nm范围内时，若可见光的波长为524 nm左右（绿光），在该波段下绿光被物体所吸收，显示出其互补色（红色），波长为604 nm左右（红光），显示颜色为绿光。因此在绿光和红光波长下吸光度之间的比值（A604nm/A524nm）能反映其颜色的改变，比值越小，说明样品红色越深；比值越大，说明绿色越深。根据图2b可知，当pH 2～9时，随pH值增加，颜色由红色变成绿色，且不断加深，且A604nm/A524nm呈指数增长。指数方程为：y＝0.243 46+0.144 47e0.2950x（R2＝0.968 5），表明花青素的颜色变化符合朗伯-比尔定律，是一种很好的天然指示剂[12]。发色团和助色团组成色素，由于基团的不稳定性，酸碱或高温等条件都会造成其结构发生转变，从而导致其颜色发生变化，最大吸收波长和吸光度随之不断改变。

图2 紫薯花青素在pH 2～12可见光谱吸收特征Fig. 2 Absorption characteristics of visible spectra of purple sweet potato anthocyanin solutions at pH 2-12

2.2 智能膜的特性

从表1可知，SCP、KCP、KSP 3 种膜之间的厚度存在差异。由于本研究智能膜的制备采用的是流延成膜法，因此在成膜过程中，成膜基材间分子内聚力和在成膜板上表面张力的差异导致了膜的性能差异。在实际应用中包装膜要求有较好的机械强度，以避免在物品流通中造成损伤。抗拉伸强度和断裂伸长率是衡量膜机械性能的重要参数[20]，由表1可知，拉伸强度从高到低依次为：SCP膜＞KSP膜＞KCP膜。SCP膜表现出最高的抗拉伸强度，膜的拉伸强度与膜分子结晶结构以及氢键有着密切的关系[21]；因此膜之间拉伸强度的差异可能由3 种原料之间羟基的数量不同而导致。KCP、SCP膜表现出较高的断裂伸长率，且与KSP膜之间存在显著性差异，说明KGM具有聚多糖高分子化合物的共性，在其分子链上有大量的羟基能与淀粉之间发生强烈的相互作用[22]。3 种智能指示膜的水溶性有着显著性差异，水溶性从大到小依次为：KCP膜＞KSP膜＞SCP膜。Ghanbarzadeh等[23]研究发现将CMC添加到淀粉中制备可降解薄膜，薄膜内部分子间形成较强的相互作用，导致水分子不易进入，从而降低薄膜的水溶性，这可能是SCP膜水溶性较小的原因；而KCP膜水溶性较大可能与其内部结构有关系。

表1 智能指示膜的机械性能、水分质量分数及水溶性Table 1 Mechanical properties, moisture contents and water solubility of intelligent indicator fi lms

2.3 智能指示膜的FTIR分析

图3 基材及智能指示膜的FTIR图谱Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of fi lm-forming solutions and intelligent indicator fi lms

从图3可以看出，成膜材料和3 种指示膜的红外吸收光谱在3 385 cm-1附近对应有明显的O—H键伸缩振动吸收峰，与马铃薯淀粉、KGM、CMC、紫薯花青素原料里面均含有丰富的羟基是一致的；在2 933 cm-1和2 888 cm-1处有明显的吸收振动伸缩峰，此处由有机化合物的特征结构—CH2和—CH引起。SCP膜的红外光谱图在1 733 cm-1处有一个强度较弱的肩峰，是由黄酮类化合物结构中呋喃环伸缩振动引起[24]。此外紫薯花青素的红外吸收光谱在1 636 cm-1和1 507 cm-1处的峰是芳香环骨架上C＝C键的振动引起，这与紫薯花青素提取物中含有丰富的芳香族化合物的特征峰极其吻合[4]。1 600 cm-1处为CMC的特征结晶峰，含有CMC的智能指示膜中对应的结晶峰发生了偏移，出现在1 593 cm-1处，表明智能指示膜内部分子之间已经形成了很强的分子间作用力，扰乱了CMC的正常状态[25]。在马铃薯淀粉的光谱中1 081 cm-1处有明显的吸收峰，可能是淀粉中C—O的伸缩和C—C的骨架振动的共同效果，在1 165 cm-1处的吸收峰是由C—O—C的伸缩振动以及C—C、C—H的骨架振动引起[26]，这些特征在KCP和KSP膜中均有体现。综上所述，在制备该类智能包装膜的过程中，各基材之间主要受分子间作用力影响，并依靠分子间作用力强弱影响膜性能表现，其基材的化学成分未发生明显改变。由于此膜中的主要成分均为可降解的生物材料，加之成膜后成分未发生改变，可预测指示膜应用于食品包装时对环境友好，可在自然环境中彻底降解。

2.4 智能指示膜的微观结构

图4 智能指示膜横切面扫描电子显微镜图（×1 000）Fig. 4 Scanning electron micrographs of the cross sections of intelligent indicator fi lms (× 1 000)

可以根据智能指示膜横切面的均匀程度来进行判断各成分之间的相容性，越粗糙其相容性越差[27]。如图4所示，SCP膜的横切面光滑紧密，未出现孔洞及裂痕，结构规整，表明其成分之间具有很好的相容性，与前文中优良的机械性能和相对较差的水溶性相吻合。KSP膜表面略带有纹路，组分均一性差。KCP膜结构松散，横截面带有孔洞，导致其断裂伸长率增加，抗拉伸强度降低，自由水易从其孔洞进入膜内部，导致其水溶性增强。

2.5 智能指示膜的颜色稳定性

图5 智能指示膜在不同温度下贮藏的色泽变化Fig. 5 Color change of intelligent indicator fi lms at different temperatures

当∆E＜3.5时颜色变化小，肉眼不可察觉[28]。如图5所示，在4 ℃和25 ℃条件下贮藏，3 种智能指示膜均表现出良好的颜色稳定性，可能是因为在温度处于50 ℃以下时花青素的降解速率缓慢，从而指示膜颜色稳定性较好[29]；同时花青素与各种基材之间相容性较好，使得花青素受一定的保护作用[30]。其中SCP膜的稳定性强于其他两种膜，可能是因为SCP膜表面更加光滑，且均匀致密，使得花青素被保护从而更加稳定，不易受外界环境影响。

2.6 智能指示膜在鱼肉新鲜度检测中的初步应用

图6 鱼肉贮藏期间TVB-N含量和智能指示膜颜色的变化Fig. 6 TVB-N values and color changes during storage of fi sh as determined by the starch/CMC indicator fi lm

由图6A可知，随着贮藏时间的延长，鱼肉的TVB-N含量、∆E均不断升高。鱼肉的初始TVB-N含量为6.53 mg/100 g，满足GB 2733—2015《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》规定的新鲜鱼肉中TVB-N含量应该小于15 mg/100 g；因此鱼肉处于新鲜状态，智能指示膜显示出暗红色。由图6A、B可知，随着贮藏时间的延长，膜的颜色越来越浅，当贮藏时间达24 h时，鱼肉的TVB-N含量达15.2 mg/100 g，超过了GB 2733—2015规定的鲜度标准，此时指示膜显示出浅红色，∆E为13.63，与鱼肉新鲜时指示膜对比颜色变化明显。当贮藏48 h时，鱼肉的TVB-N含量达到36.47 mg/100 g，鱼肉已经完全腐败，此时智能指示膜显示出浅蓝色。鱼肉贮藏过程中，在微生物和温度的影响下，鱼肉中会生成生物胺[31]，导致pH值增加，造成智能指示膜由浅红色变为浅蓝色，指示膜在48 h时∆E达25.52，且颜色变化极其明显；因此可以直接通过肉眼观察到智能指示膜颜色的变化[32]，从而判断鱼肉新鲜度。综上所述，通过贮藏过程中智能指示膜颜色的变化（暗红色→浅红色→浅蓝色）能够密切监视鱼肉的腐败过程。Zhai Xiaodong等[10]发现以玫瑰花青素为指示剂检测鱼肉新鲜度时，指示膜由红色变为蓝色，与本研究结果相似。

3 结 论

本研究所制备的SCP、KCP、KSP膜，膜中各组分相容性均较好；其中，SCP膜表现出很好的拉伸强度和断裂伸长率，且阻水性能好。SCP膜的相容性最优，横切面光滑紧密、结构规整，且颜色稳定性好。利用SCP膜对25 ℃下的鱼肉进行新鲜度实时监测，鱼肉在贮藏48 h的过程中，逐渐变得不新鲜，指示膜由暗红色变为浅红色，最后变为浅蓝色。因此，紫薯花青素是智能指示膜理想的显色材料，可用于指示鱼肉新鲜度的改变。