胃癌组织中轴蛋白、结肠癌转移相关基因1蛋白的表达及临床意义

纪雪华　秦小洁　齐卫卫

[摘要] 目的 探討胃癌组织中轴蛋白（Axin）、结肠癌转移相关基因1（MACC1）蛋白的表达及其与临床病理参数的关系。 方法 收集山东省青岛市第八人民医院2015年1月～2017年12月胃癌患者手术标本150例胃癌组织，随机抽取其中70例为癌旁组织，利用免疫组织化法检测癌及癌旁组织中Axin、MACC1的表达;分析Axin、MACC1表达与胃癌患者临床病理参数之间的关系及两者的相关性。 结果 胃癌组织中Axin阳性表达率低于癌旁组织，胃癌组织中MACC1阳性表达率高于癌旁组织，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。Axin、MACC1在胃癌组织中的表达均与胃癌的浸润深度、分化程度、淋巴结转移以及Duke分期有关（P < 0.01），且胃癌组织中Axin表达与MACC1呈负相关（P < 0.05）。 结论 Axin的表达降低及MACC1的表达升高都与胃癌发展相关，早期检测两项指标可为预测胃癌进展提供重要依据;Axin与MACC1的表达负相关，两者可能协同导致肿瘤的低分化、高侵袭、高转移性，提示两者可能成为胃癌治疗的潜在靶点。

[关键词] 胃癌;轴蛋白;结肠癌转移相关基因1;临床病理参数

[中图分类号] R735.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）05（b）-0092-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of Axin and metastasis-associated gene 1 in colon cancer in gastric cancer tissues and their correlation with clinicopathological parameters. Methods From January 2015 to December 2017， 150 surgical specimens of patients with gastric cancer in the Qingdao Eighth People′s Hospital， Shandong Province were collected as the gastric cancer tissue and randomly pick one of them 70 cases as the paracancer tissues. The expression of Axin and MACC1 in the cancer and paracancer tissues were detected by immunohistochemistry， to analyze the relationship between the expression of Axin and MACC1 and the clinicopathological parameters of gastric cancer patients and their correlation. Results The positive expression rate of Axin in the gastric cancer tissue was lower than that in the paracancerous tissue， and the positive expression rate of MACC1 in the gastric cancer tissue was higher than that in the paracancerous tissue， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The expressions of Axin and MACC1 in gastric cancer tissues were related to the invasion depth， differentiation degree， lymph node metastasis and Duke stage of gastric cancer （P < 0.01）， and the expression of Axin in gastric cancer tissues was negatively correlated with MACC1 （P < 0.05）. Conclusion The decreased expression of Axin and the increased expression of MACC1 are both related to the development of gastric cancer. The early detection of these two indicators can provide an important basis for the prediction of the progress of gastric cancer. The expression of Axin is negatively correlated with MACC1， which may synergistically lead to low differentiation， high invasion and high metastasis of the tumor， suggesting that Axin and MACC1 may be potential targets for the treatment of gastric cancer.

[Key words] Gastric cancer; Axin; Metastasis-associated gene 1 in colon cancer; Clinicopathological parameters

胃癌（gastric cancer，GC）为上消化道最常见的恶性肿瘤之一，是全球第三大导致癌症死亡的原因[1]。预后差，复发和转移为胃癌治疗中的棘手问题，目前尚无真正有效的靶向治疗[2]，因此，研究胃癌的发病机制，寻找早期诊断分子标志物及潜在新治疗靶标为目前亟需解决的问题。轴蛋白（Axin）为一种抑癌基因，目前研究[3-4]表明，其主要通过负调控Wnt信号通路抑制肿瘤，而反常表达的Axin使Wnt信号通路失去调控，细胞增殖、分化、迁移失衡，从而导致了肿瘤的发生发展，Axin广泛表达在心、肝、腦、肺、肾等正常组织中，而在脑膜瘤、乳腺癌、肾透明细胞癌、卵巢癌等多种肿瘤中表达降低或缺失。已有研究[5]发现Axin的表达与卵巢癌的临床分期、组织学分级及淋巴转移相关。结肠癌转移相关基因1（MACC1）为新发现的癌基因，首次在人复发和转移的结肠癌的基因测序中发现，除结肠癌外，在胃癌、肝癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中异常高表达，它可以通过调控肝细胞生长因子/肝细胞生长因子受体（HGF/c-MET）通路促进细胞增殖、分化、迁移，从而促进肿瘤的浸润和转移[6]。研究[7]表明，在大肠癌患者的血液检测中发现，有转移的患者MACC1水平更高。目前，关于Axin和MACC1在胃癌中的作用研究尚少，尤其是两个基因相关性的研究，本研究采用免疫组化的方法检测Axin和MACC1在胃癌及癌旁组织中的表达，分析其表达的相关性，以及其与临床病理参数的联系，拟为寻找胃癌早期诊断的分子标志物、胃癌治疗的潜在靶标提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集山东省青岛市第八人民医院2015年1月～2017年12月150例胃癌组织，并从中随机抽取70例癌旁组织，其为手术切除标本中距离胃癌组织>5.0 cm的癌旁组织。纳入标准：年龄≥18岁;诊断为原发性胃癌;术前未行放疗、化疗或其他抗癌治疗;临床资料完善。排除标准：合并其他脏器原发肿瘤或危及生命的其他器质性病变。胃癌组织150例，男81例，女69例;年龄35～69岁，平均（64.29±11.10）岁;肿瘤直径：<5 cm 82例，≥5 cm 68例;肿瘤位置：近端胃52例，胃体56例，远端胃42例;分化程度：高分化18例，中分化69例，低分化63例;浸润深度：黏膜及黏膜下层15例，黏膜层16例，黏膜外层119例;淋巴转移：有淋巴转移96例，无淋巴转移54例;Duke分期Ⅰ～Ⅱ期83例，Ⅲ～Ⅳ期67例。癌旁组织70例，男38例，女32例;年龄36～68岁，平均（64.13±12.09）岁。本研究经医学伦理委员会批准并已获得患者知情同意书。

1.2 试剂材料

兔抗人Axin多克隆抗体购于英国Abcam公司[Anti-Axin抗体（ab133221）]，兔抗人MACC1多克隆抗体购于英国Abcam公司[Anti-MACC1抗体（ab106579）]，羊血清购于碧云天公司，磷酸像冲盐（PBS）粉剂购于巨能世纪信息科技（苏州）有限公司，DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（生产批号：20141105）购于碧云天公司，加拿大中性树胶购于Solarbio公司。

1.3 免疫组化方法

所有蜡块均来源于病理科，为3 μm/片连续切片，免疫组化染色步骤：经二甲苯脱蜡，100%、95%、90%、85%梯度酒精及双蒸水中浸泡水化，在0.01 mol/L，pH 6.0枸橼酸钠溶液中高温高压抗原修复3 min，羊血清封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，Axin一抗浓度为5 μg/mL，MACC1一抗浓度为2.5 μg/mL，PBS洗涤3次，每次5 min，滴加二抗（B液∶C液=50∶1），DAB法染色。

免疫组化阳性结果由2位病理科医生进行评价，显微镜下随机观察10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，根据染色范围和强度对切片进行评价。以胞质内出现棕黄色颗粒为Axin、MACC1阳性，根据阳性细胞百分比和染色强度进行评价：阳性细胞百分比0～<5%记0分，5%～<25%记1分，25%～<50%记2分，50%～100%记3分;细胞无着色记0分，浅棕黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分;2项得分相加，0～1分为蛋白表达阴性，≥2分为蛋白表达阳性[8]。

1.4 统计学方法

用统计软件SPSS 17.0进行统计学分析，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验，两基因表达相关性采用Spearman分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Axin和MACC1在胃癌组织及癌旁组织中的阳性表达

胃癌组织中Axin的阳性表达率明显低于癌旁组织，胃癌组织中MACC1的阳性表达率明显高于癌旁组织，差异均有高度统计学意义（P < 0.001）。见表1。Spearman分析发现，Axin的表达与MACC1的表达呈负相关（r = -0.723，P < 0.05）。

2.2 胃癌组织中Axin、MACC1的阳性表达及其与临床病理参数的关系

Axin在癌中阳性表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小及位置无关，差异无统计学意义（P > 0.05），与分化程度、浸润深度、淋巴结转移、Duke分期相关，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;MACC1在癌中阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及位置无关，差异无统计学意义（P > 0.05），而与组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、Duke分期均相关，差异有高度统计学意义（均P < 0.01）。见表2。

3 讨论

胃癌为上消化道最常见的恶性肿瘤之一，位列全球癌症死亡原因的第三位。预后差，复发和转移为胃癌治疗中的棘手问题，5年生存率仅为20%～30%[9]。现有的治疗手段中，手术治疗为主要方式，而晚期患者已失去手术机会，化疗后平均生存期仅为10个月左右，目前尚无真正有效的靶向治疗，由此可见，胃癌已成为危害民众健康的重要因素。因此，从信号通路的角度来研究胃癌的发病机制及诊疗的靶标将为胃癌的治疗铺垫良好的基础。本研究从Wnt信号通路中的一个重要抑制剂Axin，以及MACC1两个新基因出发，研究两者的表达与胃癌发生发展的关系，试图寻找胃癌早期诊断的分子标志及可能的治疗靶点。

Axin为一种抑癌基因，位于人常染色体16p13.3，编码分子量约96 kDa的多结构域蛋白质[10]，它首先于1997年由学者從称为Fused的小鼠突变株中得到，它可表达于胞膜、胞质及胞核中，在胚胎发育中起重要作用，Axin的表达失控在多种恶性肿瘤中被报道，如脑膜瘤、乳腺癌、肾透明细胞癌等，在这些恶性肿瘤中，Axin的表达降低，不能发挥肿瘤抑制因子的作用[11]。近年来研究[12]显示，Axin含有多个固定保守的结构域，其中含有几个最重要的高度保守的功能结构域的磷酸化位点，其能与Wnt信号通路中许多分子相互结合来调节该信号通路中的核心分β-连环蛋白（β-catenin），Wnt信号通路被认为是多种恶性肿瘤发生发展过程中的关键通路，其中Wnt/β-catenin为最经典的信号通路，直接影响细胞的增殖分化，失调的Wnt信号通路导致细胞正常的分化、增殖失控，从而形成肿瘤。正常的Wnt信号通路中，β-catenin可被降解，其中，Axin为降解过程中的关键分子，Axin通过与腺瘤性结肠息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β）等蛋白结合，形成β-catenin降解复合物，磷酸化β-catenin，从而负性调节Wnt信号通路[13]。Axin也可通过激活应激活化蛋白激酶/氨基末端激酶（SAPK/JNK）通路及激活野生型p53，诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤的发生[14]。MACC1为Stein等[6]在人复发和转移的结肠癌的基因测序中发现的癌基因，定位于人染色体7p21.1，编码一个由852个氨基酸残基组成的结合蛋白，其在肿瘤的发生中起重要作用。已有研究[15-16]表明，MACC1在胃癌、肝癌、乳腺癌、胶质瘤中高表达。HGF/c-MET通路为与肿瘤侵袭转移相关的重要通路，正常的细胞中，c-MET呈低表达或不表达状态，在肿瘤细胞中，c-MET高表达，持续激活HGF/c-MET通路，从而促进肿瘤的侵袭和转移[17]。现有研究显示，MACC1可以调控c-MET的启动子从而促进该基因的表达，进一步激活HGF/c-MET，导致肿瘤发生恶变、侵袭和转移[18-19]。MACC1也可通过激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/β连环蛋白（Akt/β-cantenin）通路来促进肿瘤的侵袭和转移[20]。

本研究发现，胃癌组织中Axin的阳性表达率明显低于癌旁组织，而MACC1的阳性表达率明显高于癌旁组织，且其与组织分化程度、浸润深度、Duke分期、淋巴结转移均相关，提示Axin、MACC1可能为胃癌发生发展中的关键基因，Axin的低表达和MACC1的高表达导致了胃癌的低分化和高侵袭、高转移性，促进了胃癌的发生发展。Axin和MACC1的表达相关性鲜有研究，本研究通过Spearman分析，发现在胃癌中Axin的表达与MACC1的表达负相关，Axin的表达缺失或下调失去了对肿瘤的抑制作用，而MACC1的表达上调促进了肿瘤的发生发展，既往研究[21]发现，Axin和MACC1都可作用于β-cantenin，Axin表达下调及MACC1的表达上调都可促进β-cantenin的异常表达，两者可能共同参与了胃癌的发生发展过程。

综上所述，本研究通过探究Axin及MACC1在胃癌中的表达情况，分析其与临床病理参数的关系及两者相关性，提示早期检测两项指标可为预测胃癌进展提供重要线索，但两个基因的具体作用机制尚需进一步研究证实，有望为胃癌的治疗提供新的靶点。

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（收稿日期：2018-10-23  本文编辑：封   华）