枸杞丹参对视网膜色素变性大鼠视网膜组织形态学及CRYAB mRNA的影响

刘家琪　王英　蒋鹏飞　潘坤　徐剑　彭俊　彭清华

[摘要] 目的 觀察枸杞加丹参对视网膜色素变性大鼠视网膜组织形态学以及αB多肽（CRYAB）mRNA的影响。方法 将24只雌雄不拘的视网膜色素变性RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠按照随机数字表法分为模型组及杞参组，每组8只，雌雄各4只。另RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠8只，雌雄各4只，为空白组。常规喂养1周后开始灌胃，1次/d。空白组与模型组给予生理盐水，杞参组给予成人等效剂量的枸杞+丹参。连续灌胃30 d后处死，在光学显微镜下观察各组RCS大鼠视网膜的外核层厚度等形态学改变，采用qPCR检测RCS大鼠视网膜CRYAB mRNA的表达。 结果 HE染色结果显示：空白组各层视网膜结构排列整齐有序，形态规则;模型组较空白组视网膜结构排列明显疏松、变性萎缩，外核层厚度明显变薄，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;而杞参组虽与空白组比较结构较紊乱，厚度变薄，但较模型组厚度增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。qPCR结果显示：空白组大鼠在视网膜中可见CRYAB mRNA的表达，模型组大鼠视网膜CRYAB mRNA的表达较空白组明显降低（P < 0.01），杞参组大鼠视网膜CRYAB mRNA的表达较模型组升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 RCS大鼠能很好地模拟人视网膜色素变性的发病特点，其视网膜各层结构紊乱变性，外核层变薄，视网膜CRYAB mRNA的表达被抑制，而枸杞+丹参能诱导视网膜CRYAB mRNA的表达，对视网膜色素变性RCS大鼠的视网膜有一定的保护作用。

[关键词] 视网膜色素变性;枸杞;丹参;CRYAB mRNA

[中图分类号] R774.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）05（b）-0013-04

[Abstract] Objective To observe the effects of Lycium barbarum and Salvia miltiorrhiza on the morphology of retinal tissue and alpha B-crystalline （CRYAB） mRNA in rats with retinitis pigmentosa. Methods Twenty-four male and female retinitis pigmentosa RCS （rdy-/-， p-/-） rats were divided into a model group and a ginseng group according to random number table method， with 8 rats in each group， 4 males and 4 females. Another 8 RCS （rdy+/+， p+/+） rats， 4 males and 4 females， were blank group. Oral gavage was started 1 week after routine feeding， once a day. The blank group and the model group were given normal saline， and the ginseng group was given an equivalent dose of Lycium barbarum + Salvia miltiorrhiza. The rats were sacrificed for 30 days after continuous gavage. The morphological changes of the outer nuclear layer of the retina of each group were observed under light microscope. The expression of CRYAB mRNA in RCS rats was detected by qPCR. Results The results of HE staining showed that the retinal structure of each layer in the blank group was neatly arranged and regular in shape. The retinal structure of the model group was looser， with degeneration and atrophy， and the thickness of the outer nuclear layer was significantly thinner， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the blank group， the ginseng group had a disordered structure and thinner thickness， but it had increased thickness compared with the model group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The results of qPCR showed that the expression of CRYAB mRNA was observed in the retina of rats in the blank group. The expression of CRYAB mRNA in the retina of the model group was significantly decreased compared with the blank group （P < 0.01）. The expression of CRYAB mRNA in the retina of the ginseng group was higher than that in the model group and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion RCS rats can well simulate the pathogenesis of human retinitis pigmentosa. The structure of the retina is disordered， the outer nuclear layer is thinned， the expression of CRYAB mRNA in the retina is inhibited， and Lycium barbarum + Salvia miltiorrhiza can induce the expression of CRYAB mRNA in the retina. It has a certain protective effect on the retina of retinitis pigmentosa RCS rats.

[Key words] Retinitis pigmentosa; Lycium barbarum; Salvia miltiorrhiza; CRYAB mRNA

视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）是一组常见的以原发性光感受器及色素上皮功能丧失为特点的遗传特异性眼病[1-2]。病因学和流行病学资料显示，患病人数呈现逐年递增的趋势，是视网膜病主要的致盲眼病[3-4]。

大多数学者认为RP的发病部位在视网膜神经上皮层[5]，近年来又有研究者发现，RP最初病变位于视网膜色素上皮层[6]。RP的最终病理机制为细胞凋亡，αB多肽（alpha B-crystalline，CRYAB）能抑制介导细胞凋亡的p53、Caspase-3的激活，在保护视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）、光感受器细胞免受损伤的过程中发挥了重要作用[7]。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药品

RCS大鼠24只，其中RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠8只，RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠16只，1.5月龄，雌雄各半，体重75～130 g，SPF级，全部动物由昭衍（苏州）新药研究中心有限公司提供，质量合格证号：201614068，饲养于湖南中医药大学动物实验中心。枸杞、丹参中药配方颗粒，每袋相当于临床使用量饮片10 g，生产厂家为广东一方制药有限公司。

1.2 分组与给药

将16只RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠采用随机数字表法分为模型组及杞参组，每组8只，雌雄各4只。另RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠8只为空白组，雌雄各4只。

常规适应性喂养1周后开始灌胃。连续灌胃30 d，1次/d，灌胃量如下：空白组及模型组生理盐水12 mL/kg，杞参组用生理盐水配制枸杞加丹参中药配方颗粒的混合溶液。所有动物给药剂量按“人-动物体表面积等效剂量比值表”折算，折算公式：W×成人用量（mg）/动物体重（kg），其中折算系数W=0.018，成人用量参照2015年版《中华人民共和国药典》。

1.3 取材

取材时相为灌胃30 d结束后。1%苯巴比妥钠3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉满意后，摘除双眼球。每组选取1只眼球，保存于4%多聚甲醛溶液中，行常规病理切片检测。其余眼球保存于-80℃超低温冰箱中备用，供RT-qPCR检测CRYAB。

1.4 HE染色

4%多聚甲醛溶液中取出标本，酒精梯度脱水，二甲苯溶液浸泡，石蜡浸蜡，常规包埋，切片机切片，常规HE染色，封片固定。在光学显微镜下观察各标本视网膜色素上皮层、光感受器细胞层、内核层等各层结构的组织形态学改变;随机选取3个视野，用数码图像分析系统测量视网膜外核层细胞的厚度。

1.5 qPCR检测视网膜CRYAB mRNA的表达

设计引物，从NCBI中搜索并下载CRYAB目的基因序列，引物设计采用Primer 5.0软件，设计的引物由上海生工合成，具体引物序列如下：CRYAB-F为5′-CTCCAGGGTCCCCGTGGTA-3′，CRYAB-R为5′-AGGAGAGGCCAGCACCAC-3′，β-actin-F为5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，β-actin-R为5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。提取总RNA，测RNA浓度与纯度，逆转录cDNA，进行PCR检测，94℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s后延伸10 min，电泳结果使用Bio-Rad自带软件Image Lab分析得到目的条带与内参条带的光密度值比值表示。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0系统软件进行实验数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，满足方差齐性的数据采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q法检验，若方差不齐时，采用非参数秩和检验。计数资料采用完全随机设计多样本比较的秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组RCS大鼠视网膜形态学改變

空白组大鼠视网膜各层结构排列整齐有序，形态规则（图1A）。模型组RCS大鼠视网膜外层结构紊乱，光感受器细胞数量减少、厚度变薄（图1B）。杞参组大鼠视网膜各层结构尚规则，视网膜厚度较模型组增加（图1C）。

2.2 各组RCS大鼠视网膜外核层的厚度

模型组较空白组大鼠视网膜外核层厚度明显变薄，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。杞参组大鼠视网膜外核层厚度低于空白组大鼠，但较模型组RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠视网膜厚度增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.3 各组RCS大鼠视网膜上CRYAB mRNA表达情况比较

模型组CRYAB mRNA表达明显低于空白组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。杞参组CRYAB mRNA表达低于空白组，高于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

3 讨论

RCS大鼠是视网膜色素变性的经典动物模型[8]，自出生后2周起，视网膜感光细胞发生变性坏死，视锥、视杆细胞核逐渐萎缩，数量减少[9]。生长至3月龄时大部分视锥、视杆细胞消失，形成空泡[10]。RCS大鼠的RPE细胞存在一种基因突变，使RPE细胞不能吞噬脱落的膜盘，从而导致了病变的发生[11]，目前已经发现这种突变存在于受体酪氨酸酶的Mertek基因[12]。这一基因位于染色体2q14，1[13]，其突变也存在于人类RP中。CRYAB是α-晶体蛋白的一条基因编码，CRYAB除了存在于晶体，在视网膜、视神经以及心、脑等眼外组织中均有表达[14]。Alge等[15]研究发现CRYAB通过抑制介导细胞凋亡的Caspase-3的自身蛋白质水解激活，可以延缓RPE细胞的变性死亡。Mehlen等[16]还发现CRYAB可抑制或下调凋亡受体（如FAS/APO-1），减缓细胞凋亡进而保护细胞存活。

RP属于中医学“高风内障”的范畴，《证治准绳·七窍门》《目经大成·阴风障》等书中均有RP的描述。歷代医家大都认为其基本病机为“虚证”，然彭清华教授在长期的临床观察中发现RP的病机大多为虚中夹瘀，瘀始终贯穿在RP的发生发展过程，前期研究表明，枸杞加丹参较单味药枸杞、丹参能明显降低RP动物的血浆黏度、纤维蛋白原，减少视网膜的损伤因素（P < 0.05）[17-20]。

本研究中采用RCS大鼠作为实验鼠，观察了枸杞+丹参对RCS大鼠视网膜CRYAB mRNA的影响以及视网膜组织形态学的改变。结果表明：①选择RCS大鼠作为RP的动物模型，能很好地模拟人RP的发病特点;②RP大鼠视网膜各层结构紊乱变性，外核层变薄，视网膜CRYAB mRNA的表达被抑制;③枸杞+丹参能诱导视网膜CRYAB mRNA的表达，对RP大鼠的视网膜有一定的保护作用。

[参考文献]

[1]  Jones BW，Pfeiffer RL，Ferrell WD，et al. Retinal remodeling in human retinitis pigmentosa [J]. Exp Eye Res，2016， 150（2）：149-165.

[2]  Pawlyk BS，Bulgakov OV，Sun X，et al. Photoreceptor rescue by an abbreviated human RPGR gene in a murine model of X-linked retinitis pigmentosa [J]. Gene Ther，2016， 23（2）：196.

[3]  董玉萍，王磊峰，董秋艳，等.视网膜色素变性的流行病学调查[J].武警医学，2015，26（9）：950-952.

[4]  Marchena M，Villarejo-Zori B，Zaldivar-Diez J，et al. Small molecules targeting glycogen synthase kinase 3 as potential drug candidates for the treatment of retinitis pigmentosa [J]. J Enzyme Inhib Med Chem，2017，32（1）：522-526.

[5]  刘家琦，李凤鸣.实用眼科学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2015：451-453.