不同林药复合种植模式滇龙胆有效成分含量研究

杨 雁，石 瑶，田 浩，杨天梅，左智天，袁理春，金 航

(云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650205)

【研究意义】滇龙胆(Gentianarigescens)又称滇龙胆草、坚龙胆，属于龙胆科( Gentianaceae ) 龙胆属(GentianaLinn.)多年生草本植物，主要分布于四川、贵州、湖南、云南等地，是中国重要的资源植物[1]，云南是其主要的产区。滇龙胆被历版《中国药典》收录，为传统中药龙胆的基源植物，在云南有着悠久的药用历史，其具有泻肝胆火和除下焦湿热等功效[2]。近年来研究表明滇龙胆含有裂环烯醚萜、环烯醚萜、龙胆苯甲酸酯等多类成分，其中龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷和当药苷具保肝、护肝活性[3]，是滇龙胆主要的有效成分。【前人研究进展】随着药厂对滇龙胆的需求量日益增加，有限的野生滇龙胆资源已满足不了现代市场对滇龙胆药材的需求，经过多年的试验研究，目前，滇龙胆已经实现了人工规模化种植，在云南省临沧云县、永德等地是其主要道地产区[4]。关于林药复合种植的研究目前主要集中在其生态效益和经济效益[5-7]，课题成员对林药复合种植模式下药用植物有效成分含量变化也开展了很多的研究工作，但选择的复合种植模式比较单一，种类比较少[8-10]。【本研究切入点】本研究选取7种常见的滇龙胆林药复合种植模式作为研究对象，采用超声波提取法，利用高效液相色谱测定7种林药复合栽培模式下滇龙胆植株中龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、和当药苷4种有效成分含量，依据测定结果对不同种植模式滇龙胆有效成分进行方差分析和相关性分析。【拟解决的关键问题】通过对不同林药复合栽培模式下滇龙胆植株中有效成分的测定，探讨不同种植模式滇龙胆中有效成分的积累特征，以期为滇龙胆林药复合种植适应性及栽培管理提供理论依据。

表1 不同林药复合种植模式下滇龙胆生境条件Table 1 Habitat conditions of Gentiana rigescens under different intercropping patterns

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试样品于2016年11月采集自云南省临沧市云县，采样区域生长海拔相近，选取7种滇龙胆复合种植模式：包括滇龙胆与木果石栎、尼泊尔桤木、核桃树、桉树、杉木、木瓜和茶树复合种植。依照5点采样法采样，每种复合种植模式的样地面积为48 m2，分别采集滇龙胆60株，种植时间均为3年。每种种植模式随机选取10株滇龙胆样品，去除泥土，取根茎部位，将样品置于100 ℃的烘箱杀青后置于70 ℃条件下烘干至恒重，粉碎，过60目筛，避光保存备用。不同林药复合种植模式下滇龙胆生境条件见表1。

1.2 方法

实验仪器：LC-10Avp高效液相色谱仪(日本岛津公司)：SPD-M10Avp二级管阵列检测器， 7725i手动进样器；万分之一电子分析天平(美国奥豪斯)；FW-100型高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)； VE-A超纯水机(深圳宏森环保科技有限公司)；FRQ-型超声波清洗仪(杭州法兰特超声波仪器设备有限公司)。

实验试剂：对照品购自中国食品药品检定研究院(龙胆苦苷110730-201315，马钱苷酸111765-201402，獐牙菜苦苷110765-201303，当药苷114742-201131)；乙腈为色谱纯；水为超纯水；甲酸为分析纯。

1.3 色谱条件

岛津Shim-pack VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：0.1 %甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱(0～5 min，5 % B；5～10 min，5 %～10 % B；10～26 min，10 %～26 % B；26～30 min，26 %～35 % B)，流速1.00 mL/min，检测波长241 nm，柱温30 ℃，进样量10 μl。

1.4 溶液制备

1.4.1 对照品溶液制备 精密称取龙胆苦苷38.0 mg、马钱苷酸10.0 mg，獐牙菜苦苷8.0 mg，当药苷7.5 mg对照品溶液，分别用甲醇定容至10 mL容量瓶中，摇匀，得到对照品储备溶液，置于4 ℃冰箱避光保存备用。

分别取各对照品储备液1 mL，于10 mL容量瓶中混合均匀，用甲醇定容至刻度，得混合对照品溶液，置于4 ℃冰箱避光保存备用。按1.3 色谱条件进样，得色谱图(图1)。

1：马钱苷酸；2：獐牙菜苦苷；3：龙胆苦苷；4：当药苷1: Loganic acid; 2: Swertiamarin; 3: Gentiopicroside; 4: Sweroside图1 混合对照品图Fig.1 HPLC chromatograms of standard samples

1.4.2 供试品溶液制备 精密称取0.2 g样品粉末于10 mL具塞试管中，加入10.00 mL 35 %乙醇溶液，超声提取50 min，待溶液冷却至室温后称重，甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm微膜过滤，取滤液得供试样品溶液。

1.5 方法学考察

1.5.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。分别吸取10 μl进样。以对照品溶液浓度为横坐标X(mg/mL)，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算回归方程，见表2。

1.5.2 精密度实验 精密吸取同一对照品溶液各10 μl，在1.3色谱条件下连续进样6次，计算峰面积，RSD值分别为龙胆苦苷0.85 %、马钱苷酸0.92 %、獐牙菜苦苷1.08 %、当药苷1.29 %，表明仪器精密度良好。

1.5.3 重复性实验 精密称取各6份，依照1.4.2的方法制备供试品溶液，在1.3色谱条件下进行测定，计算峰面积RSD值分别为1.12 %、2.05 %、1.85 %和2.24 %，表明供试品溶液重复性良好。

1.5.4 稳定性实验 精密称取同一滇龙胆样品0.2 g，依照1.4.2的方法制备供试品溶液，在0、2、4、6、8、12 h 内记录峰面积，计算RSD值分别为0.73 %、1.05 %、1.21 %和1.93 %，表明在12 h内稳定性良好。

1.5.5 回收率实验 精密称取0.2 g已知含量的滇龙胆样品(3次重复)，分别按高(120 %)中(100 %)低(80 %)浓度加入4种对照品，依照1.4.2的方法制备供试品溶液，在1.3色谱条件下测定，记录色谱图，计算回收率，结果显示4种有效成分的平均回收率分别为100.41 %、96.03 %、96.5 %和97.9 %，表明此方法准确度较高(表3)。

1.6 数据分析

采用Excel 2016和DPS 7.05统计分析软件对实验数据进行方差分析及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 七种林药复合种植模式滇龙胆有效成分含量及方差分析

由表4可知，滇龙胆中马钱苷酸的含量在滇龙胆-核桃复合种植模式下最高(9.74 mg/g)，在滇龙胆-桉树复合种植模式下最低(5.78 mg/g)，滇龙胆-核桃复合种植模式下马钱苷酸的含量显著高于其它6种复合种植模式。滇龙胆中獐牙菜苦苷的含量在滇龙胆-桉树复合种植模式下的含量最高(10.82 mg/g)，在滇龙胆-茶树复合种植模式下的含量最低(8.25 mg/g)，滇龙胆-桉树复合种植模式下獐牙菜苦苷的含量显著高于滇龙胆-茶树、滇龙胆-尼泊尔桤木、滇龙胆-木瓜复合种植模式，其余种植模式差异不显著。滇龙胆中龙胆苦苷的含量在滇龙胆-尼泊尔桤木复合种植模式下最高(85.99 mg/g)，在滇龙胆-杉木复合种植模式下最低(49.55 mg/g)，滇龙胆-尼泊尔桤木复合种植模式下龙胆苦苷含量除与滇龙胆-桉树复合种植模式差异不显著外，与其它5种复合种植模式龙胆苦苷含量差异显著。滇龙胆中当药苷的含量在滇龙胆-杉木复合种植模式下的含量最高(2.05 mg/g)，在滇龙胆-木瓜复合种植模式下的含量最低(1.5 mg/g)，7种复合种植模式当药苷的含量差异均不显著。

表2 回归方程与线性范围Table 2 Linear relations and linear ranges

表3 回收率实验Table 3 Recovery experiment

方差分析结果表明：不同林药种植模式对滇龙胆根茎中龙胆苦苷、马钱苷酸、獐芽菜苦苷含量有显著影响。

2.2 不同林药复合种植模式滇龙胆有效成分的相关性分析

不同林药复合种植模式滇龙胆有效成分的相关性分析(表5)结果显示，龙胆苦苷和獐牙菜苦苷含量呈极显著正相关(R=0.35，P< 0.01)，当药苷分别与马钱苷酸和獐牙菜苦苷含量呈极显著正相关(R=0.49，P< 0.01；R=0.41，P< 0.01)。

表4 不同林药复合种植模式滇龙胆有效成分含量的比较Table 4 Comparison of effective components of Gentiana rigescens from different intercropping patterns

注：同列中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Note: Different lowercase in same column indicates significant difference (P<0.05).

表5 不同林药复合种植模式滇龙胆有效成分的相关性分析Table 5 Correlation analysis of effective components of Gentiana rigescens from different intercropping patterns

注：**表示在P< 0.01水平(双侧)上显著相关。
Note: ** means significant correlation atP< 0.01 level.

3 讨 论

光是影响植物次生代谢产物形成的重要环境因素[11]，研究表明药用植物药效成分的产生和积累受生态环境因素的影响，光照、水肥条件等对药用植物的有效成分也有影响[12～13]。研究发现不同光照条件下三花龙胆(GentianatrifloraPall.) 中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的含量有显著变化，因此不同颜色和波长范围的光照可影响植株体内化学成分的变化[14]。在7种林药复合种植模式，尼泊尔桤木和木果石栎均为高大乔木，株高可达15～30 m，林冠稀疏，因此在尼泊尔桤木和木果石栎复合种植下的滇龙胆生境条件光照十分充足，滇龙胆植株生长较好；与茶树套种，茶树比较低矮，株高低于1.5 m，种植区域均为台地茶，行间距在1 m左右，生境条件光照不充足，不利于滇龙胆生长；核桃树、木瓜株高有3～5 m，但这两种树种枝叶比较稠密，套种在这两种模式林下光照条件较差；桉树为高大乔木，根系发达，蒸腾作用比较强，对土壤水分需求量较高，对土壤养分需求量巨大，不利于其他植物生长，因此滇龙胆-桉树复合种植条件下，滇龙胆植株生长情况也不是太好；杉木为高大乔木，对滇龙胆生境条件光照影响较小，但杉木对土壤水分和养分需求量较高，根系比较浅，侧根、须根发达，与滇龙胆根系生长的耕层土壤在同一区域，也不利于滇龙胆根系的生长。

这7种复合种植模式下滇龙胆有效成分测定结果显示，滇龙胆与尼泊尔桤木复合种植植株有效成分总含量最高，与木果石栎复合种植滇龙胆植株有效成分总含量次之，与杉木复合种植有效成分总含量最低。有研究显示不同的栽培模式改变了植物生长的环境，对植物生长产生特定的刺激，最终造成其质量的差别[15]；在光照强度较高的生境中药材有效成分含量高于光照强度较低的生境[16]；适宜的间作复合生态系统可以改善生态环境小气候。

4 结 论

通过对7种不同林药复合种植模式滇龙胆有效成分含量进行分析，滇龙胆所处的生境不同，所接受的光照、温度、水分等也不同，加之植物之间的化感作用，滇龙胆有效成分含量差异显著，滇龙胆不同林药复合种植模式下有效成分含量变化可能与其生长的微环境有关，还需从植物学、植物生理学、栽培学等方面进行深入研究，为提高滇龙胆药材品质及复合生态种植技术提供指导性数据。