水稻粒长粒重主效基因GS3的功能标记开发与利用

伍 豪，高利军，黄 娟，高 菊，卿冬进，戴高兴，梁海福，周维永*

(1.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007；2.广西农业科学院水稻研究所，广西 南宁 530007)

【研究意义】水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球超过一半以上的人口以稻米为主食。随着生活水平的提高，消费者对优质米的要求是不仅口味适合，还要粒形美观。在水稻育种过程中，粒形也是必须选择的性状，因为粒形不仅影响水稻的产量，也影响着稻米的外观品质和商品价值[1]。水稻粒型已成为当前消费者与育种家的共同关注热点之一。一般说来，水稻粒形包括粒长、粒宽、粒厚及长宽比等性状，而粒长是最能反映粒形的指标[2]。在南方地区，由于高温“逼熟”，谷粒越宽灌浆越难，导致米质下降，一般细长粒稻米的垩白率较低，其外观品质也较好[3]。粒长负调控基因GS3在第2外显子中编码第55位的密码子发生了无义突变，导致蛋白翻译提前终止，蛋白的C-端178个氨基酸缺失，从而使得OSR结构域功能丧失，水稻粒形变长[4]。因此，建立GS3基因的功能标记用于分子标记辅助选择育种将对水稻粒长及品质的改良发挥重要作用。【前人研究进展】Wang等[5]利用近等基因系对GS3长粒等位基因进行聚合育种，其研究结果表明GS3基因对增加粒长和粒重起到非常关键的作用。杨梯丰等[6]利用携带有GS3基因的单片段代换系进行聚合育种，证实了该基因在不同的遗传背景下均具有谷粒增长的效应。张剑霞等[7]利用标记SF28将GS3的长粒等位基因聚合到了珍汕97B和II-32B中，获得各自粒长得到改良的株系。【本研究切入点】Fan等[8]开发的标记SF28需要使用限制性内切酶，操作繁琐，成本高，不利于育种应用。因此，开发出不用酶切，直接利用琼脂糖凝胶电泳检测产物的功能标记，并将该标记运用于改良综合性状优良的水稻亲本粒长中，以助推利用GS3基因的分子标记辅助选择长粒型水稻品种的育种工作。【拟解决的关键问题】利用GS3基因与其等位基因的序列差异，开发出GS3基因的功能标记，对24个水稻亲本材料进行基因分型，并结合粒长表型分析，验证标记的有效性。同时，将GS3长粒等位基因导入短粒水稻亲本中，利用该标记进行辅助选择，以期获得粒长增加的优良水稻亲本材料。

1 材料与方法

1.1 供试材料

含有GS3长粒等位基因的长粒水稻品种宜香B，粒长为10.1 mm，含有GS3基因的短粒水稻品种美B，粒长为7.9 mm。24个在水稻育种中广泛使用的亲本(表1)及宜香B与美B杂交、回交后的BC2F7群体。

1.2 试验方法

1.2.1 标记设计 从 NCBI 网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载水稻粒型基因GS3序列，序列号为DQ355996，利用 Primer Premier5.0软件对GS3序列进行分析和设计引物。根据Fan[4]等报道的GS3基因中第 2 外显子上的编码区+165位置C-A单碱基替换，设计出含有3条引物的标记M-GS3.

1.2.2 材料种植与DNA提取 供试水稻材料全部种植于广西农业科学院水稻试验田，于插秧后14 d单株取叶片，按Murray[9]等的CTAB法提取水稻DNA。

1.2.3 粒型测定 利用SC-G型自动种子拷种仪测量24个水稻品种和BC2F7群体中的入选单株。每个品种随机取10个单株，每株随机选取100粒饱满籽粒测定，取平均值作为粒长的表型值。

1.2.4 PCR扩增 反应体系为20 μl：2.0 μl的 10×Buffer、2.0 μl的 dNTPs(2.5 mmol/L)、4 μmol/L 的引物gs3F、gs3In和gs3R各1.0 μl、0.2 μlTaqDNA聚合酶(5 U/ μl)，2.0 μl模板DNA，12.8 μl ddH2O。PCR反应程序为94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，循环35次；最后72 ℃延伸10min得到扩增物，将扩增产物在添加了5 μl Biotium公司生产的GelRed核酸染料的1.5 %琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外灯下观察拍照。

1.2.5 育种应用 利用含有GS3长粒等位基因的水稻保持系宜香B为供体亲本，保持系美B为受体亲本进行杂交，在后用美B为轮回亲本，后代用标记M-GS3选择含粒长等位基因GS3存在的单株连续回交到BC2F1，然后连续自交，并结合标记选择与粒长表型测定，最后从BC2F7群体中选择农艺性状与美B一致且粒长显著超过美B的株系。

2 结果与分析

2.1 GS3基因功能标记的建立

根据粒型基因GS3的序列中第2外显子上的编码区+165位置的1个由碱基C到碱基 A的单核苷酸替换，首先设计了一条能匹配长粒等位基因GS3的引物gs3In：GCAGGCTGGCTTACTtTCTT，在其3′端引入了一个错配碱基T，并在其上游设计一条引物gS3F：ATTGGCTTGATTTCCTGTGC，下游设计一条引物gs3R：TTGCTCTTACGGGAGGACAC。3条引物同时在PCR体系中进行扩增，GS3长粒基因的序列与gs3In只有一个碱基错配，可以扩增出720和308 bp的两条带；而GS3短粒等位基因与引物gs3In有2个碱基错配，不能扩增出308 bp的条带来，只有1条720 bp的条带。这样扩增产物不需要进行酶切，直接电泳检测是否含有两条带，就能检测出样品中是否含GS3长粒等位基因。

2.2 GS3的功能标记在育种亲本中的验证

利用引物M-GS3对24份不同粒长的水稻亲本材料进行检测(图1)。检测结果显示，在泰丰B，内香B，协青早B等11份材料中含有长粒等位基因GS3，而其他材料中不含有该基因(表1)。对24份材料的粒长测定显示，含有GS3长粒等位基因的品种粒长为8.7～13.1 mm，明显大于粒长位于6.7～8.5 mm的含有短粒等位基因GS3的品种。这一结果表明，引物M-GS3可以准确的检测出不同水稻材料中是否含有GS3长粒等位基因，这将有助于发掘含有GS3长粒等位基因的水稻材料，为水稻粒型改良的育种工作提供材料基础。

表1 24个水稻品种及其粒长表型和基因性Table 1 Phenotype and genotype of grain length of 24 rice varieties

2.3 GS3的功能标记对水稻粒型的改良

利用标记M-GS3对美B与宜香B的BC2F7群体进行检测(图2)，并对其农艺性状进行调查，根据基因型及粒长表型，筛选到10株农艺性状与美B接近，粒长大于9.5 mm的株系。将这些株系与其亲本美B和宜香B的农艺性状进行比较(表2)，发现改良后的美B材料82B其长宽比为4.14，远超过两亲本的长宽比，其千粒重，粒长，粒宽，长宽比，等与产量和品质相关的性状相对于亲本美B来说都得到了提高，经t检验表明，这几个性状与美B相比都达到了极显著；而82B的株高、穗长、有效穗和结实率等性状与美B接近，t检验表明这些性状与美B无显著差异(图3)。这充分说明了利用宜香B为GS3长粒等位基因的供体亲本，并利用M-GS3为标记的分子标记辅助选择对美B粒长和产量的提高的有效性。

M：Marker200；1： II-32B；2： BX-16；3：岗46B；4：特B；5：良丰B；6：112B；7：西菲B；8：龙丰B；9：博IIB；10：158B；11：地谷B；12：福伊B；13：谷梅4号；14：02428；15：南粳46；16：BL122；17：博IIIB；18：协青早B；19-B5；20：IRBB7；21：L427；22：金23B；23：内香B；24：泰丰BM:Marker200；1:II-32B；2:BX-16；3:Gang 46B；4:Te B；5:Liangfeng B；6:112B；7:XifeiB；8:Longfeng B；9:Bo IIB；10:158B；11:Digu B；12:Fuyi B；13:Gumei 4；14:02428；15:Nanjing 46；16:BL122；17:Bo IIIB；18:Xieqing:zao B；19:B5；20:IRBB7；21:L427；22:jin 23B；23:Neixiang B；24:Taifeng B图1 24个水稻品种分子标记的电泳图Fig.1 Detection of 24 rice varieties by marker M-GS3

M:Marker200；1～5、7～24：含有GS3长粒等位基因的材料；6：含有GS3短粒等位基因的材料M:Marker200;1-5,7-24:Materials containing GS3 long grain allele；6:Materials containing GS3 short grain allele图2 标记M-GS3对BC2F7群体进行检测Fig.2 Detection of BC2F7 population by marker M-GS3

表2 亲本和入选单株的农艺性状比较Table 2 Comparison of agronomic characters between parents and selected individuals

注：*代表与美B相比的t检验值达到极显著性差异(P<0.05)。
Notes：* indicate significant difference with t-test by comparing with MeiB(P<0.05).

3 讨 论

谷粒长度不仅影响水稻的产量性状——千粒重，也影响稻米的外观品质和商品价值[10]。因此，广大育种工作者都十分关注对水稻粒长的改良。在水稻粒型改良的育种工作中，GS3是少数在常规品种中已经广泛受到人工正向选择，并在生产中发挥作用的粒长基因[11]。在对GS3长粒等位基因的利用中，前人多采用CAPS标记及连锁标记进行选择。Fan等[8]基于GS3基因第2外显子的C-A突变，开发了一个酶切扩增多态性序列(CAPS)标记SF28，并用与育种实践。李扬等[12]用含有GS3长粒等位基因的长粒品种三粒寸、IAC1246、JAPPENI、TUNGKUNGO和MIGA作为供体亲本，SAGC4为受体亲本，采用标记SF28，对GS3长粒等位基因进行选择，从BC2F2代分离群体中直接筛选出长粒且综合农艺性状好的优良单株，证实了不同供体亲本对受体亲本SAGC4粒长增加的贡献基本相同，都可以达到快速改良SAGC4粒长和长宽比性状的目的。方珊茹等[13]将GS3长粒等位基因及其他外观品质性状基因导入水稻材料II-32B中，在利用连锁标记MR5881和GS09对GS3长粒等位基因进行选择，获得了粒长、谷粒长宽比和粒重均得到改良的株系。本研究利用GS3基因与其等位基因的序列差异，设计出了标记M-GS3，该标记是位于基因内的功能标记，产物不用酶切，相较于连锁标记及CAPS标记有着准确度高，操作简便，成本低等特点。利用标记M-GS3对含有不同粒型基因的24份水稻亲本材料及育种群体材料进行检测，发现该标记能够在不同遗传背景的水稻材料中准确的鉴定出GS3基因及其等位基因，说明了该标记可以用于对GS3基因的分子标记辅助育种及对水稻种质资源中的GS3基因进行鉴定。这将有利于推进GS3基因在水稻粒型改良中的更广泛使用，并为培育出长粒型优质水稻提供材料基础。

本研究利用美B和宜香B进行杂交，将宜香B中的GS3长粒等位基因导入美B中，在以美B为轮回亲本，经连续回交和自交，并结合M-GS3标记的检测及粒长表型鉴定，选育出了粒长改良后的美B材料82B，其平均粒长为9.87 mm。通过t检验表明，82B的粒长，千粒重，长宽比等与产量和米质相关的性状都得极显著提高，而株高，穗长，有效穗数和结实率等性状与美B接近，变化不显著。这一结果与Wang等[5]的研究结果GS3基因对增加粒长和粒重起到非常关键的作用一致，也进一步验证了标记M-GS3对GS3基因选择的有效性及GS3基因对水稻粒长和粒重影响的主效性。

图3 亲本与改良后代的粒长表型Fig.3 Grain length phenotype of parents and improved progenies

4 结 论

通过对GS3基因的序列进行分析，开发出了GS3基因的功能标记M-GS3。通过对不同水稻亲本材料及育种改良群体材料的检查并结合粒长测量，发现该标记可有效的对水稻中的GS3基因进行选择。利用该标记对导入了GS3长粒等位基因的美B材料进行辅助选择，获得了粒长，千粒重和长宽比都显著高于美B，而其他农艺性状与美B接近的材料，这些材料可进一步运用到优质稻育种中。