牛IgG2 Fc受体的真核表达、纯化与结晶

黄晓静，李 睿，马红芳，冯丽丽，乔松林，邓瑞广，张改平,3

(1 河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002；2 河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；3扬州大学 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州225009)

Fc受体(Fc receptor，FcR)是一类特异亲和免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)Fc片段的细胞表面分子[1-2]。FcR广泛表达于免疫细胞表面，介导免疫细胞与抗原-抗体复合物的相互作用，从而发挥对异己物质的识别与清除、抗原处理与呈递等免疫学功能，是联系体液免疫与细胞免疫的重要桥梁[3-5]。

根据FcR结合配体Ig种类(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)的不同，可将FcR分为5大类，即FcγR、FcαR、FcμR、FcδR和FcεR，其中FcγR是最重要的一类FcR[6-8]。根据FcγR亲和力及功能的不同，可将其分为FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ，分别结合不同的IgG亚类[9-10]。1995年，本研究团队首次利用牛巨噬细胞cDNA文库克隆出一种新的FcγR，其与所有已发表的人和小鼠FcγR差异较大，但与人Ⅰ型FcαR(huFcαRⅠ)相似度较高[11-12],其只特异性亲和牛IgG2而不亲和人和牛IgA，为一种新型哺乳动物FcR，将其命名为牛IgG2 FcR(boFcγ2R)[11]。此后，本团队进一步研究发现，绵羊也存在Fcγ2R基因，该受体能结合牛和绵羊IgG2，但不能结合绵羊IgG1，表明Fcγ2R可能是反刍动物特有的一类FcγR[13]。

boFcγ2R是一种跨膜糖蛋白，由2个胞外Ig-like区域EC1(Extracellular 1)和EC2(Extracellular 2)及包含19个氨基酸的跨膜区和一段短的胞质尾区组成。2001年，Morton等[14-15]利用定点突变的方法研究证明，boFcγ2R与IgG2特异亲和的区域位于EC1的F-G loop区，并指出第82-85位氨基酸是其特异性结合位点。2006年，本研究团队利用合成多肽技术进一步证明，boFcγ2R第82位的苯丙氨酸(F82)、83位异亮氨酸(I83)及87位的色氨酸(W87)在特异性亲和过程中发挥着关键作用[16]。

FcR及其与配体复合物的结构生物学研究，不仅可为阐明二者相互作用的分子机制提供技术支持[17-18]，同时也可为FcR靶标药物的研发奠定重要基础[19]。boFcγ2R作为一种新型FcR，对其三维结构进行研究，不仅能够为揭示boFcγ2R的功能提供分子基础，也能为深入研究人类FcR与Ig的相互作用提供借鉴。本研究利用果蝇胚胎DrosophilaSchneider 2(S2)细胞表达系统获得了boFcγ2R胞外区重组蛋白，经过纯化得到了纯度高、具有活性的目的蛋白，并获得初筛晶体，旨在为后续boFcγ2R的结构与免疫学功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

果蝇胚胎S2细胞、pMT/BiP/V5-HisA、pCoBlast载体、牛IgG2、猪源CD163重组蛋白，均为本实验室保存[20]；大肠杆菌DH5α感受态细胞、DL2000 DNA Marker，均购自大连宝生物有限公司；Q5®High-Fidelity DNA 聚合酶、限制性核酸内切酶BglⅡ、MluⅠ及T4 DNA连接酶，均购自美国New England Biolabs公司；DNA回收试剂盒，购自北京天根生化有限公司；E.Z.N.A.®Plasmid Midi Kit 质粒提取试剂盒，购自美国OMEGA公司；Cellfectin®II Reagent阳离子脂质体转染试剂、果蝇胚胎S2细胞无血清培养基Sf-900 II(serum-free medium，SFM)、筛选抗生素blasticidin S HCl，均购自美国Invitrogen公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，购自美国Gibco公司；纯化用镍填料、Superdex 200 Increase 10/300 GL预装柱，均购自美国GE公司；His标签抗体(anti-6×His tag monoclonal antibody)，购自武汉三鹰生物技术有限公司；山羊抗小鼠酶标二抗(goat-anti-mouse IgG-HRP)，购自美国Abbkine公司；偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)、硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)、超滤管，均购自美国Millipore公司；化学发光HRP底物显色液、彩虹180蛋白Marker、245 plus蛋白Marker、BCA蛋白浓度测定试剂盒，均购自北京索莱宝科技有限公司；果蝇胚胎S2细胞培养基(Schneider’s insect medium)、去糖基化酶Endo Hf和PNGase F，均购自美国Sigma公司；48孔晶体板及结晶试剂盒，购自美国Hampton Research公司。

1.2 pMT/BiP-boFcγ2R-His重组表达载体的构建

从GenBank下载boFcγ2R全长基因序列(GenBank登录号：NM-001001138)，交由上海生工生物工程有限公司合成boFcγ2R全长基因，根据其全长氨基酸序列，采用TMHMM Server v. 2.0软件预测boFcγ2R胞外区片段。根据预测的boFcγ2R胞外区片段序列，利用Prime5软件设计1对PCR扩增引物。其中上游引物F:5′-GAAGATCTCAGGTGCAGGCCGGCACCTTC-3′(下划线标识BglⅡ酶切位点),下游引物R:5′-CGACGCGTATTCTGCATGGTGTAATCGGCCAC-3′(下划线标识MluⅠ酶切位点)。以boFcγ2R全长基因为模板，使用Q5高保真DNA聚合酶对boFcγ2R胞外区进行PCR扩增，PCR反应体系按照Q5高保真DNA聚合酶使用说明书配制，同时设置以水代替模板的体系作为阴性对照。PCR反应体系(50 μL)为：2×Master Mix 25 μL，上游引物boFcγ2R-F(10 μmol/L)2 μL，下游引物boFcγ2R-R(10 μmol/L)2 μL，模板2 μL，ddH2O 19 μL。反应条件为：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环；最后72 ℃二次延伸 10 min。PCR扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后回收。

回收的boFcγ2R胞外区片段经BglⅡ和MluⅠ双酶切处理后，与经同样双酶切处理的pMT/BiP/V5-HisA通过T4 DNA连接酶进行连接，构建pMT/BiP-boFcγ2R-His重组表达载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性(氨苄青霉素的质量浓度为100 μg/mL)筛选获得单克隆菌落；挑选5个单克隆菌落进行PCR鉴定，将阳性克隆送至上海生工生物工程有限公司测序。

1.3 pMT/BiP-boFcγ2R-His果蝇胚胎S2细胞稳定转染细胞系的筛选

将pMT/BiP-boFcγ2R-His与pCoblast混合，通过Cellfectin®II Reagent脂质体转染果蝇胚胎S2细胞[20]；3 d后，更换含体积分数10%热灭活FBS的果蝇胚胎S2细胞培养基，同时添加终质量浓度为25 μg/mL的blasticidin S HCl抗生素进行筛选，每隔3 d左右更换1次培养液，观察细胞状态，最终得到稳定转染的细胞系。

1.4 boFcγ2R胞外区重组蛋白的表达

使用果蝇胚胎S2细胞SFM培养基对筛选出的稳定转染细胞系进行扩大培养，待细胞密度达到(3～6)×106个/mL时，加终浓度为0.75 mmol/L的硫酸铜，28 ℃诱导表达120 h后，4 ℃下200g离心10 min，收集上清液，调节其pH至8.0后，4 ℃下12 000g离心30 min，收集上清液。上清液样品经SDS-PAGE电泳后，在15 V、40 min条件下转PVDF膜，采用His标签抗体对目的蛋白进行Western-blot鉴定。

1.5 boFcγ2R胞外区目的蛋白的纯化

量取一定体积浸泡在体积分数20%乙醇中的镍填料进行装柱，用10倍柱体积的超纯水冲洗后，以10倍柱体积的缓冲体系(20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl)对镍柱进行平衡处理。将离心后的S2细胞表达上清液加至平衡后的镍柱中，让其自然缓慢地流过镍柱，流穿结束后再次用10倍柱体积的上述缓冲体系平衡，然后依次使用10，30，50，100 mmol/L的咪唑溶液进行洗脱处理，并分别收集洗脱液样品。对纯化前S2细胞表达上清液、过镍柱后流穿液及不同浓度咪唑洗脱液样品进行SDS-PAGE检测。使用凝胶过滤层析柱Superdex 200 Increase 10/300 GL对经过镍柱纯化后的蛋白进一步纯化，并将收集的蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定，最后利用超滤管对收集的目的蛋白进行浓缩，并使用BCA试剂盒测定蛋白的质量浓度。

1.6 boFcγ2R胞外区蛋白的Dot-blot检测

根据boFcγ2R可与牛IgG2特异性结合的特点，利用His单抗对结合牛IgG2后的boFcγ2R胞外区重组蛋白进行检测。将牛IgG2(质量浓度为1 mg/mL)以10 μL的量点样于NC膜，自然干燥后浸入50 g/L脱脂奶中，于4 ℃封闭过夜，分别用0.5，1.0和2.0 μL的boFcγ2R胞外区重组蛋白液(质量浓度为1.0 mg/mL)对其进行孵育，同时设置空白对照(不含任何蛋白)及阴性对照(加2 μL质量浓度为1.0 mg/mL的带His标签的猪源CD163重组蛋白)；以His标签抗体作为一抗(1∶5 000)，37 ℃作用1 h，PBST洗涤3次；加入HRP标记的羊抗鼠作为二抗(1∶1 000)，37 ℃作用1 h，PBST洗涤3次；最后使用化学发光HRP底物显色液对NC膜进行显色，对目的蛋白功能进行Dot-blot检测。

1.7 boFcγ2R胞外区蛋白结晶条件的筛选

将纯化后的boFcγ2R胞外区蛋白经超滤管浓缩至12.6 mg/mL，备用。采用蛋白结晶筛选试剂盒HR2-144(其中包括96个结晶条件)，用蒸汽扩散坐滴法在不同结晶条件下对目的蛋白进行结晶，筛选蛋白结晶条件。具体做法为:将浓缩后的蛋白液与不同结晶条件溶液按照1∶1的体积比加至晶体板，置于20 ℃晶体培养箱中，每天数次观察晶体板中有无晶体生长。

1.8 boFcγ2R胞外区蛋白的去糖基化处理

挑取初筛晶体送至上海同步辐射光源BL17U1线站收集数据，结果显示本研究得到的初筛晶体无衍射。因之前有报道称，boFcγ2R属于糖基化修饰的蛋白，所以推测boFcγ2R胞外区蛋白初筛晶体无衍射可能是其糖基化造成的。因糖基化最常见的形式是N-糖基化，所以同时利用2种去N-糖基化酶Endo Hf 和PNGase F，分别在变性与非变性条件下对目的蛋白进行去糖基化处理。取适量纯化后的目的蛋白，在变性及非变性条件下分别与去糖基化酶Endo Hf、PNGase F混合，37 ℃孵育1 h，然后利用SDS-PAGE电泳检测boFcγ2R胞外区蛋白的去糖基化效果。

2 结果与分析

2.1 pMT/BiP-boFcγ2R-His载体的构建及鉴定

利用合成的boFcγ2R全长基因为模板扩增出其胞外区cDNA片段，结果得到了约633 bp的片段(图1)，与预期结果一致。pMT/BiP-boFcγ2R-His载体PCR鉴定获得了约633 bp的目的片段(图2)，测序鉴定结果也显示获得了633 bp的片段，表明pMT/BiP-boFcγ2R-His载体构建成功。

M.DL 2000 DNA标准品; 1.阴性对照；2.boFcγ2R基因胞外区片段扩增产物
M.DL 2000 DNA Marker; 1.Negtive control；2.PCR amplification product ofboFcγ2Rgene segment of extracellular region
图1boFcγ2R基因胞外区片段的PCR扩增
Fig.1 PCR amplification ofboFcγ2Rgene segment of extracellular region

M.DL 2000 DNA标准品;
1-8.单克隆菌落的pMT/BiP-boFcγ2R-His基因胞外区片段PCR扩增结果
M.DL 2000 DNA Marker; 1-8.Colony PCR products of pMT/BiP-boFcγ2R-His gene segments of extracellular region
图2 pMT/BiP-boFcγ2R-His载体的PCR鉴定
Fig.2 Colony PCR identification of pMT/BiP-boFcγ2R gene segments of extracellular region

2.2 boFcγ2R胞外区重组蛋白的诱导表达与纯化

收集诱导后的S2重组细胞表达上清液，利用His标签抗体进行Western-blot分析，结果在26 ku左右出现目标蛋白条带(图3)，表明boFcγ2R胞外区重组蛋白诱导表达成功。

对镍柱亲和层析法纯化前S2细胞表达上清液、过镍柱后流穿液及不同浓度咪唑洗脱液样品进行SDS-PAGE检测，结果表明50 mmol/L咪唑洗脱液中含有目的蛋白(图4)。

M.蛋白Marker；1.稳定转染的S2细胞表达上清液 M.Protein Marker；1.Supernatant of stably-transfected S2 cells 图3 boFcγ2R胞外区重组蛋白的Western-blot检测Fig.3 Western-blot analysis of recombinant boFcγ2R ectodomain

M.蛋白Marker；1.纯化前细胞表达上清液；2.过镍柱后流穿液；3～5.分别为10，50 和100 mmol/L 咪唑洗脱液M.Protein Marker；1.Cell supernatant before purification；2.Flowthrough after purification;3-5.Eluent with 10,50,100 mmol/L imidazole respectively图4 镍柱纯化boFcγ2R胞外区重组蛋白的SDS-PAGE检测Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant boFcγ2R ectodomain purified by Ni-affinity chromatography

采用镍柱亲和层析初步纯化后的目的蛋白中仍有部分杂蛋白没有除去，因此采用凝胶过滤层析对其进一步纯化，SDS-PAGE检测结果表明，凝胶过滤层析纯化后的蛋白纯度较镍柱纯化明显提高(图5)；进一步经超滤管浓缩后，蛋白质量浓度高达12.6 mg/mL。

M.蛋白Marker；1.凝胶过滤层析纯化后的目的蛋白；2.超滤管浓缩后的目的蛋白M.Protein Marker;1.Recombinant target protein purified by gel filtration chromatography; 2.Concentrated target protein by ultrafiltration tube 图5 凝胶过滤层析纯化boFcγ2R胞外区重组蛋白的SDS-PAGE检测Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant boFcγ2R ectodomain purified by gel filtration chromatography

2.3 boFcγ2R胞外区重组蛋白活性的Dot-blot检测

试验结果(图6)显示，纯化后的boFcγ2R胞外区重组蛋白可与牛IgG2结合，表明目的蛋白具有生物学活性。

1.空白对照；2.阴性对照；3～5.分别为0.5，1.0，2.0 μL boFcγ2R胞外区重组蛋白的孵育结果1.Blank control；2.Negative control；3-5.Results of incubated 0.5,1.0,2.0 μL recombinant boFcγ2R ectodomaint respectively图6 boFcγ2R胞外区重组蛋白功能的Dot-blot鉴定Fig.6 Dot-blot analysis of recombinant boFcγ2R ectodomain

2.4 boFcγ2R胞外区重组蛋白结晶条件的确定

纯化后目的蛋白的纯度、质量浓度、活性均满足结晶要求，因此本研究利用蛋白结晶筛选试剂盒HR2-144对蛋白结晶条件进行筛选，最终蛋白结晶的2个条件是体积分数15%TacsimateTM(pH 7.0)、0.1 mol/L HEPES (pH 7.0)、20 g/L PEG 3350和0.1 mol/L HEPES (pH 7.5)、250 g/L PEG 3350(图7)。

A.15% TacsimateTM (pH 7.0)、0.1 mol/L HEPES (pH 7.0)、20 g/L PEG 3350条件下24 h生长的晶体；B.0.1 mol/L HEPES (pH 7.5)、250 g/L PEG 3350条件下24 h生长的晶体A.Crystals grown in the condition of 15% TacsimateTM (pH 7.0),0.1 mol/L HEPES (pH 7.0),20 g/L PEG 3350 for 24 h;B.Crystals grown in the condition of 0.1 mol/L HEPES (pH 7.5),250 g/L PEG 3350 for 24 h图7 boFcγ2R胞外区重组蛋白初筛晶体Fig.7 Primary screening crystals of recombinant boFcγ2R ectodomain

2.5 boFcγ2R胞外区重组蛋白的去糖基化分析

试验结果显示，在变性条件下，boFcγ2R胞外区重组蛋白经去糖基化酶Endo Hf和PNGase F处理后，得到较纯的单一目的蛋白条带(图8)，从而验证了boFcγ2R胞外区重组蛋白初筛晶体无衍射可能与其糖基化有关。

M.蛋白Marker；1，3.分别为非变性条件下去糖基化酶Endo Hf和PNGase F处理后的目的蛋白；2，4.分别为变性条件下去糖基化酶Endo Hf和PNGase F处理后的目的蛋白M.Protein Marker;1,3.The target protein treated with Endo Hf and PNGase F under non-denatured condition;2,4.The target protein treated with Endo Hf and PNGase F under denatured condition图8 经去糖基化酶处理后boFcγ2R胞外区目的蛋白的SDS-PAGE检测Fig.8 SDS-PAGE analysis of recombinant boFcγ2R ectodomain after de-glycosylation

3 讨 论

FcR不仅使免疫细胞具备杀伤病毒和细菌、清除免疫复合物、溶解癌变细胞的能力，而且还参与免疫反应的启动与调节，在机体免疫防御方面起着极为关键的作用[1]。相对人FcR而言，牛FcR研究比较滞后。boFcγ2R作为一种新型哺乳动物FcR[21]，对其结构和功能进行研究具有非常重要的意义。2008年，本研究团队曾经利用原核表达系统表达了boFcγ2R胞外区，验证了其可与IgG2特异结合[22]。但是，由于原核系统表达的蛋白不能进行翻译后加工，如糖基化修饰及二硫键形成等，可能导致重组表达蛋白的结构与天然结构不符。在真核系统表达方面，本研究团队在克隆boFcγ2R时，采用瞬时转染的方法通过COS-7细胞成功表达了boFcγ2R，并对其功能进行了鉴定[23]。然而，瞬时转染受很多因素影响，有可能出现转染效率低的问题；同时，瞬时转染表达无法保证不同批次试验的均一性及稳定性。此后，本研究团队通过抗性筛选和玫瑰花环检测方法建立了稳定表达boFcγ2R的COS-7转染细胞系，虽然为研究boFcγ2R功能提供了很好的技术平台[21]，但是通过此方法获得的蛋白量远远不能满足后续对其结构与功能研究的需求。

本研究构建pMT/BiP-boFcγ2R-His表达载体，通过果蝇胚胎S2细胞真核表达系统对目的蛋白进行了表达。利用该真核表达系统，目的蛋白可在翻译后进行加工修饰使其更接近蛋白天然构象，同时该系统还具有蛋白表达量高等特点[20,24-25]。采用镍柱亲和层析及凝胶过滤层析纯化后，经SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度高达99%。经Dot-blot检测纯化后的boFcγ2R胞外区重组蛋白具有特异结合牛IgG2的生物学活性。本研究最终获得了目的蛋白初筛晶体，但是这些晶体无衍射。经分析，boFcγ2R属于糖基化修饰蛋白，推测可能是糖基化不均一所致。为了验证这个推测，本研究采用2种去糖基化酶对目的蛋白进行去糖基化处理，结果发现处理后可获得纯度较高而且均一的目的蛋白，为进一步利用结构生物学方法研究该受体的免疫学功能打下了坚实基础。