隐匿性HBV感染患者HBV S基因突变特点及突变病毒株致瘤性研究

李 奇，张 凯，思兰兰，陈建宏，刘桃园，纪 冬，李晓东，刘 妍，徐东平

隐匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection,OBI）是指现有技术检测血清HBsAg阴性，但血清和/或肝组织HBV DNA阳性的HBV感染状态[1]。目前OBI流行情况差异较大，检出率约为0.002%～0.180%[2-4]，与HBV流行区、人群血清学特点、样本数量及检测方法灵敏度等有关。目前肝病人群中OBI的发生率少有报道。

OBI的发生机制尚未完全阐明，已鉴定的OBI相关突变多位于HBV S基因主要亲水区（major hydrophilic region, MHR），MHR内发生碱基替换、插入或缺失突变，可能会发生新增N-糖基化突变，即在原有s146-148 NCT N-糖基化位点基础上，增加NXT/S（X为P以外的任何氨基酸残基）新的N-糖基化位点。既往研究显示前S/S基因突变与肝脏疾病尤其是肝细胞癌的进展密切相关[5-8]，而S基因新增N-糖基化突变是否具有致瘤性尚不清楚。本研究回顾性分析了10 359例肝病患者临床资料，了解患病人群中OBI检出率及HBV S基因MHR突变特点，同时对1例典型OBI患者来源的1株新型N-糖基化突变病毒株体外细胞水平致瘤性进行分析，具体情况报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2011年9月—2016年3月在中国人民解放军总医院第五医学中心就诊并收集到血清样本的10 359例肝病患者作为研究对象，包括2904例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）患者，1371例药物、酒精、自身免疫以及不明原因肝炎患者，4258例肝硬化（liver cirrhosis, LC）患者，1557例肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）患者，218例肝衰竭患者和51例HBV、HCV合并感染患者。OBI诊断标准依据2008年欧洲肝脏研究学会在意大利发布的专家共识[1]。

新型突变株来源患者：诊断为原发性肝癌，4次采集患者血清，HBsAg的检测值均为阴性，但血清中HBV DNA均为阳性，且病毒载量随病程进展逐渐升高[9]。

1.2 细胞与主要试剂 人肝癌细胞系HepG2细胞购自美国模式菌种收集中心；胎牛血清、高糖培养基及嘌呤霉素（puromycin, PM）购自美国Gibco公司；pLVX-Puro慢病毒表达载体质粒购自北京典型培养物保藏中心；质粒提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；X-tremeGENE HP转染试剂盒购自德国Roche公司；去糖基化酶PNGase F购自美国NEB公司；组氨酸（histidine, His）标签蛋白小鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗购自北京全式金公司；Super Signal West Pico化学发光液购自美国Thermo Fisher公司；细胞划痕试验专用培养插件购自德国Ibidi公司；细胞增殖试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）购自上海翊圣生物公司；细胞小室迁移分析试剂盒购自美国Corning公司；细胞周期和活性氧检测试剂购自上海碧云天公司。相关引物及测序由北京天一辉远公司完成。

1.3 方法

1.3.1 筛选OBI患者并分析HBV S基因MHR特点 筛选血清HBsAg阴性、HBV DNA阳性人群即OBI患者，分析其临床诊疗资料并检测其HBV S基因序列。通过MegAlign软件分析比对MHR突变情况，比对的HBV标准序列（AF458664C2、AB033554）来自 NCBI。

1.3.2 pLVX-Puro-S重组质粒构建 从课题组前期构建的野生型及突变型质粒中扩增S基因和His标签[10]，将EcoR I和Xba I双酶切PCR产物获得的126-127“RPCMNCTI”插入新增N-糖基化突变株（N-glycosylation, NG）和野生株（wild- type,Wt）克隆入pLVX-Puro慢病毒表达载体，获得pLVX-Puro-S-NG、pLVX-Puro-S-Wt重组质粒。

1.3.3 稳定细胞株的筛选和鉴定 将构建成功的重组质粒转染至对数生长期的293 T细胞来包装病毒，收集病毒上清并感染人肝癌细胞系HepG2细胞，用终浓度4 μg/ml的PM筛选出空载体对照组HepG2-Mock、野生组HepG2-Wt以及突变组HepG2-NG稳定细胞系。收集3组细胞，用含蛋白酶抑制剂的裂解液冰上裂解细胞，离心后收集上清。将上清样品分成2份，1份用沸水煮10 min使蛋白充分变性，1份用去糖基化酶PNGase F处理，然后用Western Blotting方法鉴定His标签目的蛋白的表达。

1.3.4 突变病毒株致瘤性分析实验

1.3.4.1 CCK-8检测细胞增殖能力 调整3组细胞浓度为 5×104个 /ml，取 100 μl接种于 96 孔板，按照CCK-8试剂盒说明书方法分别在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h检测吸光值。

1.3.4.2 细胞划痕实验 3组细胞分别接种于细胞划痕实验培养插件中（每孔2.4×104个细胞/80 μl），待细胞贴壁后拔除插件，分别于0 h和48 h在显微镜下测量划痕宽度并拍照，计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h划痕宽度-相应时间点划痕宽度）/0 h划痕宽度。

1.3.4.3 细胞小室迁移实验 以无血清培养基调整3 组细胞浓度为 2.5×105个 /ml，取 200 μl加入上室中，下室加入600 μl含20% FBS的完全培养基。培养24 h后用棉球擦拭除去上室非迁移细胞，经4%多聚甲醛固定并用结晶紫染色，光学显微镜下计数穿膜细胞数量。

1.3.4.4 平板克隆实验 将3组细胞按每孔1000个细胞接种到6孔板中，细胞培养箱中培养14 d后用4%多聚甲醛固定并用结晶紫染色，计数细胞克隆数量。

1.3.4.5 细胞周期检测 收集处于对数生长期的3组细胞，每组1×106个细胞。加入4 ℃预冷的70%乙醇溶液固定过夜，加入碘化丙啶染色液，37 ℃孵育30 min，上流式细胞仪进行细胞周期检测。

1.3.4.6 细胞活性氧（reactive oxygen species, ROS）检测 将3组细胞按每孔1×106个细胞接种于6孔板中。待80%融合时，加入终浓度为10 μM荧光探针DCFH-DA，37 ℃孵育30 min，按试剂盒说明书检测ROS含量。

以上6个试验每组均设3个复孔，并做3次独立重复实验。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。非正态分布的计量资料以中位数（四分位间距）表示，即M（Q25，Q75），组间比较采用非参数秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝病人群OBI检出率及S基因MHR突变特点 从10 359例患者中筛选出检测了血清HBsAg和HBV DNA的患者7323例，其中筛出血清HBsAg阴性及HBV DNA阳性的患者14例，OBI检出率为0.191%（14/7323）。14例OBI患者中有7例直接测序成功，4例检出9种HBV S基因MHR突变，其中126-127“RPCMNCTI”插入和F161S为新型变异。见表1。

表1 14例OBI患者基本资料Table 1 Basic information of 14 OBI patients

2.2 稳定细胞株重组HBV S蛋白的Western Blotting鉴定 结果显示，Wt产生的HBsAg-His标签融合蛋白由2个条带组成，即1条27 kD非糖基化条带（HBsAg分子量24 kD，融合His和myc标签后增加约3 kD）和1条固有s146-148NCT N-糖基化条带（30 kD，1个N-糖基化修饰使蛋白约增加3 kD），而新增N-糖基化NG融合蛋白显示3个条带（33 kD、30 kD、27 kD）（图1A）。用去糖基化酶PNGase F处理后，所有融合蛋白只剩余1条27 kD的非糖基化条带（图1B）。

图1 细胞内HBsAg-His融合蛋白表达的Western Blotting分析A.PNGase F处理前各细胞株目的蛋白表达情况；B.PNGase F处理后各细胞株目的蛋白表达情况；NG.126-127“RPCMNCTI”插入；Mock.空白对照；β-tublin.内参Figure 1 Western Blotting analysis of intracellular recombinant HBsAg-His expression

2.3 新增N-糖基化突变对人肝癌HepG2细胞增殖的影响 在前3个时间点，HepG2-Mock组、HepG2-Wt组和HepG2-NG组的细胞增殖率无明显差异（F1=0.748，P=0.513；F2=2.695，P=0.146；F3=1.857，P=0.236），而在后3个时间点尤其是第6时间点，HepG2-NG组细胞增殖率明显高于HepG2-Mock组和HepG2-Wt组（F4=12.454，P=0.007；F5=14.451，P=0.005；F6=52.256，P=0.000），而HepG2-Mock组和HepG2-Wt组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图2，吸光度与细胞数量成正比，吸光度值的增加反应细胞的增殖情况。结果表明新增N-糖基化突变促进HepG2细胞的增殖。

2.4 新增N-糖基化突变对人肝癌HepG2细胞迁移的影响 细胞划痕实验显示在划痕后48 h时间点，HepG2-NG组细胞迁移率明显高于HepG2-Mock组 和 HepG2-Wt组（P均 ＜ 0.05， 见 图3A、表2）；细胞小室迁移实验结果显示，实验24 h时间点HepG2-NG组穿膜细胞数量明显高于HepG2-Mock组和HepG2-Wt组（P均＜0.05，见图3B、表2），而HepG2-Mock组和HepG2-Wt组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明新增N-糖基化突变可显著促进HepG2细胞的迁移能力。

图2 3组细胞在不同时间点的增殖率Figure 2 The proliferation rates of cells in 3 groups at different time points

图3 细胞划痕和细胞小室迁移实验比较3组细胞的迁移能力A.通过细胞划痕实验对3组细胞的伤口愈合能力进行分析，比较0～48 h各组细胞的迁移率，HepG2-NG组明显增高，显微镜下代表性图片（100×）；B.通过细胞小室迁移实验对3组细胞穿过聚碳酸酯膜的能力进行分析，比较各组细胞24 h时间点穿过膜的细胞数量，HepG2-NG组明显增多，显微镜下代表性图片（结晶紫染色，200×）Figure 3 Comparison of migration ability of cells in 3 groups by scratch and transwell assay

2.5 新增N-糖基化突变对人肝癌HepG2细胞克隆形成能力的影响 通过细胞平板克隆实验对3组细胞接种后贴壁成活并形成克隆的能力进行分析，可以比较各组细胞的克隆形成率。结果显示，在6孔板里生长14 d后，HepG2-NG组细胞克隆形成率明显高于HepG2-Mock组和HepG2-Wt组（P均＜0.05，见图4、表3），而HepG2-Mock组和HepG2-Wt组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。表明新增N-糖基化突变可显著促进HepG2细胞的克隆形成能力。

表2 48 h时3组细胞的迁移率及24 h 3组细胞穿膜细胞数Table 2 The migration rate of cells at 48 h and the number of transmembrane cells at 24 h in 3 groups

图4 平板克隆实验比较3组细胞的克隆形成能力Figure 4 Comparison of colony formation ability of cells in 3 groups by colony formation assay

表3 3组细胞14 d时克隆形成率Table 3 The clonal formation rate of cells in 3 groups at 14 d

2.6 新增N-糖基化突变对HepG2细胞周期的影响 流式细胞术分析显示，HepG2-NG组处于S期细胞与HepG2-Mock组和HepG2-Wt组比较明显增多（P＜0.05，见图5、表4），而HepG2-Mock组和HepG2-Wt组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），S期细胞增多表明HepG2-NG组细胞增殖活跃。

2.7 新增N-糖基化突变对HepG2细胞内ROS含量的影响 通过DCF荧光值反应细胞内ROS含量，检测结果显示，HepG2-NG组细胞中ROS含量的荧光值为（3704.2±103.2），比HepG2-Mock组（2786.5±149.3）和 HepG2-Wt组（2943.4±86.2）明显增强，且差异有统计学意义（P＜0.05，见图6），而HepG2-Mock组和HepG2-Wt组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

图5 流式细胞术检测比较3组细胞的细胞周期Figure 5 Comparison of cell cycle in 3 groups by flow cytometry

OBI呈全球性分布，且在不同人群中都有检出，如献血者、接受免疫抑制剂或化疗药物治疗者及健康人群等，但肝病人群中OBI的检出率鲜有报道。OBI与HBV再激活密切相关，且研究表明OBI可能是HCC发展的一个危险因素，因此，肝病人群中OBI的检出率也应该受到关注。

表4 3组细胞处于S期细胞所占比例Table 4 The proportion of cells in S phase in 3 groups

图6 新增N-糖基化突变对HepG2细胞内ROS含量的影响F=53.694，P=0.000，n=3Figure 6 Effect of additional N-glycosylation mutation on the ROS of HepG2 cells

本研究回顾性分析中国人民解放军总医院第五医学中心血清样本库中检测了血清HBsAg和HBV DNA的7323例患者样本资料，其中筛出OBI患者14例，OBI检出率为0.191%（14/7323），明显高于我国献血员人群OBI检出率（0.015%～0.097%）[2-3,11]，分析原因可能是本研究中的肝病患者存在一定比例的HBV感染者，发生病毒变异导致OBI的可能性较大，而献血员人群一般为健康人群。由于OBI患者的血清HBV DNA载量都偏低，给测序带来了难度，14例患者中仅有7例测序成功。其中4例检出9种HBV S基因MHR突变，除126-127“RPCMNCTI”插入和F161S为新型变异外，其余均为已报道的OBI相关突变。14例OBI患者中有7例HCC（占50%），在测序成功的4例HCC样本中有3例检出OBI相关突变（占75%）。OBI患者中HCC占较高比例，HCC患者中亦有较高的OBI相关位点突变检出率，可能预示着发生OBI相关突变与较差的预后相关。

N-糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰方式，可帮助蛋白空间构象正确折叠，增加蛋白的稳定性和亲水性，维持蛋白抗原性[12]，MHR过度糖基化影响蛋白构象，掩盖表面抗原，是病毒逃逸免疫应答的重要机制之一[13]。课题组从1例OBI患者血清中检出的新型突变126-127“RPCMNCTI”插入发生了新增N-糖基化突变，且该患者进展为HCC。新近的研究显示突变的HBV蛋白在肝细胞内质网上聚集可能引起基因组不稳定，从而促进HCC发生[14-15]。本课题组前期研究结果也显示新增N-糖基化突变可显著降低HBsAg的抗原性[16]，且影响病毒分泌，使病毒在细胞内聚集[17]。临床病例随访分析显示携带有新增N-糖基化突变的患者发生HCC的风险增加[18]。但新增N-糖基化突变是否具有直接引起肝细胞的异常增生与转化的作用尚未见报道。本研究通过细胞增殖、平板克隆、细胞划痕、细胞小室迁移和细胞周期等实验发现该新增N-糖基化突变可显著促进HepG2细胞增殖、克隆形成和迁移能力，而且突变株细胞内ROS水平明显增高。

综上所述，该新增N-糖基化突变降低了HBsAg抗原性，导致HBV免疫逃逸从而无法被机体有效清除，使机体长期处于隐匿性感染状态，包膜蛋白过度N-糖基化修饰错误折叠，影响正常分泌，蛋白质聚集在内质网，引起氧化应激使得ROS水平增高，容易造成慢性炎性损伤，而肝细胞在反复修复损伤中增加了细胞异常增生转化的机率，这些作用累加最终使得该种突变具有促进肿瘤生长的细胞生物学特点，从而具有增加慢性HBV感染患者向HCC进展的潜在风险。

因HepG2细胞裸鼠成瘤性较差，限制了对N-糖基化突变致瘤性的裸鼠成瘤实验分析，但本课题组新近又建立了新增N-糖基化突变的Huh7细胞系，并验证N-糖基化突变在Huh7细胞中有相似的致瘤性，后期将通过N-糖基化突变的Huh7细胞验证其裸鼠成瘤性，提供更有力的数据支持。

总之，本研究表明肝病人群中有较高的OBI检出率，且新发现的HBV S基因126-127“RPCMNCTI”插入新增N-糖基化突变在体外细胞水平（HepG2细胞）具有促瘤作用，提示新增N-糖基化突变可能是HCC的发生机制之一。