赤芝灵芝多糖与重金属元素的质量评价研究

姜 涛，施枝江，罗 安，黄发军，姚艺新，陈纯纯，翁玉萍

(康美药业股份有限公司，广东 揭阳 515300)

灵芝来源于多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(leyss. ex Fr.)Karst.或紫芝GanodermasinenseZhao，Xu et Zhang 的干燥子实体，性平、味甘，归心、肺、肝、肾经，具有“补气安神，止咳平喘”之功效，临床上用于治疗心神不宁、失眠心悸、肺虚咳喘、虚劳短气、不思饮食等[1]。现代研究表明，灵芝中含有多糖、三萜类化合物、有机酸、蛋白质、氨基酸等多种有效成分，具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、调节免疫等作用[2-9]。目前市面上流通的灵芝以赤芝用量较大，灵芝多糖是灵芝的有效成分之一，2015版《中国药典》评测灵芝多糖含量以无水葡萄糖(C6H12O6)的含量来计算，且以不得少于0.90%作为评价指标之一[1]。近年来，中药的安全性成为大家关注的焦点。2001年我国对外贸易经济合作部颁布的《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》对药用植物原料、饮片中的铅(Pb)、镉(Cd)、汞(Hg)、铜(Cu)、砷(As)实施了限量要求[10]，说明这5种重金属元素的含量是评价药材重金属安全性的重要内容。目前《中国药典》2015版未对重金属元素进行限量要求，现有的文献研究更多侧重于微量元素的测定，未对赤芝的安全性评价进行全面研究，更未对其有效成分与重金属元素进行相关性分析[11-13]。

电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法具有灵敏度高、准确性好、精密度高、检出限低，线性范围宽等优点[14，15]。为此，本研究通过建立测定赤芝灵芝多糖的紫外分光光度法和5种重金属含量的ICP-MS法，测定含量，运用主成分分析法比较不同样品重金属元素的差异，并结合多元相关性分析法研究灵芝多糖与5种重金属之间的相关性，以期为赤芝的质量评价提供参考依据，现报道如下。

1 仪器、试剂及药材

UV-2501PC紫外可见分光光度计(岛津公司)；数显恒温水浴锅(常州恒隆仪器有限公司)；XS105DU型电子天平(d=0.01 mg，梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ-300VDB三频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；安亭DL-5-B离心机(上海安亭科学仪器厂)；DGG-9030B鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)；Multiwave PRO微波消解仪为奥地利安东帕公司生产；ICP-MS 7700x电感耦合等离子体质谱仪为安捷伦科技有限公司生产。

D-无水葡萄糖(批号：110833-201506)购于中国食品药品检定研究院(北京)；Pb(批号GSB04-1742-2004 )、Cd(批号GSB04-1721-2004)、Hg(批号 GSB04-1729-2004)、Cu (批号GSB04-1525-2004 )、As (批号GSB04-1714-2004)、Cr(批号GSB04-1723-2004)、Ge(批号GSB04-1728-2004 )、In(批号GSB04-1731-2004)、Bi(批号GSB04-1719-2004)、Au(批号GSB04-1715-2004)标准液均由国家有色金属及电子材料分析测试中心生产；无水甲醇、冰醋酸、苯酚、高氯酸、冰醋酸、乙酸乙酯、香草醛均为分析纯，由广州化学试剂厂生产；盐酸、活性炭、碘化钾、硫酸均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产；丙酮、无水乙醇、乙醚均为分析纯，由广东光华科技股份有限公司生产；硫氰酸铬铵由上海华精生物高科技有限公司生产。

14份赤芝药材样品分别从安徽各地收集，由康美药业股份有限公司质量管理部刘茂贵主任药师鉴定为多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(leyss. ex Fr.)Karst的子实体。样品信息见表1。

表1 14份赤芝样品灵芝多糖和5种重金属元素的含量及综合得分

注：F值为主成分分析的综合得分值。

2 方法

2.1 灵芝多糖的含量测定

2.1.1 对照品溶液的配制 取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含0.12 mg的溶液，即得。

2.1.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置10 mL具塞试管中，各加水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，摇匀)6 mL，立即摇匀，放置15 min后，立即置冰浴中冷却15 min，取出，以相应的试剂为空白对照，在625 nm波长处测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得A=0.027 54X+0.022 06，r=0.999 0。

2.1.3 供试品溶液的配制 取本品粉末约2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水60 mL静置1 h，加热回流4 h，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤纸置烧瓶中，加水60 mL，加热回流3 h，趁热滤过，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣用水5 mL溶解，边搅拌边缓慢滴加乙醇75 mL，摇匀，在4 ℃放置12 h，离心，弃去上清液，沉淀物用热水溶解并转移至50 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，取溶液适量，离心，精密量取上清液3 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

政治文本中的隐喻翻译研究——以《2016年政府工作报告》为例 卫明高,余高峰,乔俊凯 40(2)120

2.1.4 灵芝多糖的方法学考察 精密度考察：取同一份灵芝样品供试液，连续6次测定吸光度，其RSD为0.45%(n=6)，表明仪器的精密度良好。稳定性考察：取同一份灵芝样品的供试液，分别于制备后0、10、20、40、60、80、120 min 测定吸光度，其RSD为1.34%(n=7)，表明所用供试液在2 h内稳定。重复性考察：取同一份灵芝样品粉末6份，制备成供试液，测定灵芝多糖的含量，其RSD为1.65%(n=6)，表明所用方法的重复性良好。加样回收试验：精密称取2 g已测定灵芝多糖含量的灵芝样品粉末6份，分别精密加入与样品中灵芝多糖含量相当的无水葡萄糖对照品溶液，制备供试液，测定灵芝多糖的含量，其平均回收率为98.24%，RSD为1.68%(n=6)，表明所用方法的准确性良好。

2.1.5 样品测定 精密量取供试品溶液2 mL，置10 mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“2.3.2”项下“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得。

2.2 Pb、Cd、As、Hg、Cu的含量测定

2.2.1 铅、镉、砷、铜、汞标准品贮备液的制备 分别精密量取铅、砷、镉、汞、铜单元素标准溶液适量，用10%硝酸溶液稀释制成1 mL分别含铅、砷、镉、汞、铜为1 μg、0.5 μg、1 μg、1 μg、10 μg的溶液，即得标准品贮备液。

2.2.2 内标溶液的制备 精密量取锗、铟、铋单元素标准溶液适量，用水稀释制成每1 mL各含1μg的混合溶液，即得。

2.2.3 ICP-MS的测定条件 等离子气流量：15.0 L·min-1；蠕动泵转速：0.20 r·s-1；雾化室温度：2 ℃；辅助气流量：0.8 L·min-1；He气流量：5 mL·min-1；载气流量：0.8 L·min-1；射频功率：1 550 W；数据采样模式：跳峰采集模式；采样深度：10 mm；重复次数：3次；描次数：100次。

2.2.4 标准曲线的制备 精密量取铅、镉、铜、砷标准品贮备液适量，用10%硝酸溶液稀释制成每1 mL含铅、砷0 ng、1 ng、5 ng、10 ng、20 ng，含镉0 ng、0.5 ng、2.5 ng、5 ng、10 ng，含铜0 ng、50 ng、100 ng、200 ng、500 ng的系列浓度混合溶液，即得。另精密量取汞标准品储备液适量，用10%硝酸溶液稀释制成每1mL分别含汞0ng、0.2ng、0.5ng、1ng、2ng、5 ng的溶液，本液应临用配制。63Cu、75As以72Ge作为内标，114Cd以115In作为内标，202Hg、208Pb以209Bi作为内标，绘制标准曲线，详见表2。

表2 重金属元素的回归方程及相关系数

2.2.5 供试品溶液的制备 取供试品于60 ℃干燥2 h，粉碎成粗粉，取0.5 g，精密称定，置耐压耐高温微波消解罐中，加硝酸5～10 mL(如果反应剧烈，放置至反应停止)。密闭并按微波消解仪的相应要求及一定的消解程序进行消解。消解完全后，消解液冷却至60 ℃以下，取出消解罐，放冷，将消解液转入50 mL量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入金单元素标准溶液(1 μg/mL)200 μL，用水稀释至刻度，摇匀，即得(如有少量沉淀，必要时可离心分取上清液)。除不加金属元素标准溶液外，余同法同时制备试剂空白溶液。

2.2.6 方法学考察 精密度试验：取混合标准品溶液连续进样 6次，测定这5种元素的量，Pb、Cd、Hg、Cu、As的RSD分别为 3.12%、1.54%、1.66%、1.17%、2.12%、2.33%。表明仪器的精密度良好。重复性试验：取同一份赤芝样品粉末6份，制备成供试品溶液，测定这6种元素的量。Pb、Cd、Hg、Cu、As的RSD值分别为1.21%、2.11%、1.15%、1.38%、2.54%，表明此方法的重复性良好。稳定性试验：取同一份赤芝样品供试液，在选定样品测定条件下，分别于制样后 0、5、10、15、20、25、30、35 h 进样，测定这5种元素的量。Pb、Cd、Hg、Cu、As的RSD值分别为1.38%、1.52%、2.01%、2.22%、2.96%，表明在样品制备35 h内各成分是稳定的。

3 结果与分析

3.1 赤芝中灵芝多糖含量的比较

14份赤芝样品灵芝多糖的含量均符合2015年《中国药典》的要求，含量范围为0.95% ～ 2.55%，平均值为1.35%(n=14)。

3.2 赤芝5种重金属元素含量的比较

14份赤芝铅元素有2份样品未检出，平均值为0.12 mg/kg(n=14)；镉元素有4份样品未检出，平均值为0.12 mg/kg(n=14)；砷元素有1份样品未检出，平均值为0.07 mg/kg(n=14)；汞元素有6份样品未检出，平均值为0.02 mg/kg(n=14)；铜元素有5份样品未检出，平均值为3.41 mg/kg(n=14)。

把14份赤芝5种重金属元素含量的结果代入SPSS19.0统计学软件，设置提取因子数目为5，进行主成分分析，得到解释的总方差和成分矩阵，结果见表3、表4。

表3 解释的总方差 (%)

注：提取方法为主成分分析。

表4 成分矩阵a

注：a.提取方法为主成分分析；已提取了5个成分。

分析表3总方差的解释和表4成分矩阵，结果表明，5个主成分的初始特征值分别为1.768、1.496、1.013、0.525、0.198，累积百分比为100%，计算得到主成分1、2、3、4、5的表达式分别为：

Z1=0.801*Pb+0.69*Cd+0.706*As+0.329*Hg+0.208*Cu

Z2=0.458*Pb-0.441* Cd-0.569*As+0.791*Hg+0.379*Cu

Z3=0.017*Pb-0.226* Cd+0.151*As-0.441*Hg+0.863*Cu

Z4=-0.283*Pb+0.521* Cd-0.313*As+0.108*Hg+0.252*Cu

Z5=-0.261*Pb-0.081* Cd+0.241*As+0.246*Hg+0.068*Cu

把5个主成分相加，得到总的表达式Z总=2.303*Pb+0.589*Cd+0.433*As+1.424*Hg+1.955*Cu，把5种重金属元素的含量代入Z总，得到每份样品的综合得分值，详见表1。

14份赤芝5种重金属元素的主成分分析的结果有所不同，综合得分值越高，安全性越低。1～14号样品的综合得分值分别为9.227、0.238、10.944、6.344、2.025、0.091、0.549、18.551、10.848、12.671、0.548、0.193、15.202、10.962，说明不同赤芝样品之间的重金属方面的安全性不同。

3.3 赤芝灵芝多糖与重金属元素的相关性分析

把5种重金属元素的含量作为自变量，灵芝多糖的含量作为因变量，带入SPSS19.0统计学软件进行逐步回归分析，结果见表5至表8。

表5 输入/移去的变量b

注：已输入所有请求的变量；因变量：灵芝多糖。

表6 模型汇总

注：a. 预测变量：(常量)，铜，砷，汞，镉，铅。

表7 ANOVAb

注：a.预测变量：(常量)，铜，砷，汞，镉，铅；b.因变量：灵芝多糖。

表8 系数a

注：a. 因变量：灵芝多糖。

从表8可以看出，只有镉元素与灵芝多糖的相关性通过可靠性分析，P=0.045<0.05，相关系数为-0.025，说明镉元素与灵芝多糖呈负相关，二者的表达式为：Y(灵芝多糖)=-0.025*X(镉元素)+0.012。

产地、菌种、菌丝体、菌株对灵芝中灵芝多糖的含量都有不同程度的影响[16-20]。而生长期对灵芝中灵芝多糖含量影响较大，现蕾期时最高，芝盖形成期有所降低，成熟期又有所增加，衰老期又大幅度降低[21]。在生长过程中，UDPGPPlase、α-PGM和PGI是灵芝多糖合成的关键酶[22]，各部位基质中的灵芝胞外酶活性与物质量具有一定的相关性[23]。灵芝不同部位的多糖含量差异较大，即：发酵菌丝体>菌盖表皮层>孢子粉>菌柄>木栓层[24]。不同生长时期的灵芝用不同体积分数乙醇沉淀灵芝多糖，人工栽培与野生对灵芝多糖也有一定影响[25，26]。这说明产地、菌种、菌丝体、菌株、生长期等对灵芝中灵芝多糖均有不同程度的影响；而不同样品中5种重金属元素的含量有所不同，可能与赤芝自身对某些元素的富集或者与环境的污染有关，需要进一步深入研究。

4 结语

本研究建立的赤芝灵芝多糖的紫外分光光度法和5种重金属元素含量的ICP-MS方法准确、可靠、重现性好。从药效的角度来看，不同赤芝样品的质量存在一定差异，从安全性的角度来看，其安全性有所不同。镉元素与灵芝多糖呈负相关，即镉元素含量越高，灵芝多糖的含量越低。