野菊花不同部位蒙花苷含量测定及HPLC指纹图谱研究

郑继标，杨红梅，黄春华，陈柳葵，聂娟

(1.湛江中心人民医院 药学部，广东 湛江 524000；2.澳门大学 健康科学学院，澳门999078；3.广州中医药大学，广东 广州 511400)

野菊花为菊科植物野菊(ChrysanthemumindicumL.)的干燥头状花序，具有清热解毒、泻火平肝之功效，临床用于目赤肿痛、臃肿疔疮、头痛眩晕的治疗[1]。野菊花为野菊花栓、复方野菊花降压颗粒等中药制剂的主要原料。其资源丰富，分布于吉林、辽宁、湖北、广西等我国大部分地区。野菊花含有黄酮类、萜类、多糖等多种化学成分[2]。现代药理学研究表明，野菊花具有抗炎、镇痛、抗菌、抗肿瘤、降压、保肝等药理作用[3]。

作为药食两用的植物，野菊花在药品、食品、化妆品等领域具有较大的开发利用价值。最新版药典记载入药的主要部位为野菊花的头状花序，而实际上野菊花的其他部位在古籍与现实生活中也被证实具有较高的药用价值。蒙花苷是野菊花含量较高的重要化学成分之一，但关于野菊花的花、茎、叶部位的蒙花苷含量测定及HPLC指纹图谱比较还未曾见报道。因此本研究对野菊花的花、茎、叶中的蒙花苷含量进行测定，同时尝试建立三个部位的HPLC指纹图谱，以期为野菊花不同部位的资源开发与临床利用提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津高效液相色谱仪(LC solution-20A)；万分之一电子分析天平(XB120A型，Precisa公司)；十万分之一电子分析天平(CP225D型，德国Sartorius公司)；电热恒温振荡水槽(DKZ系列，上海一恒科技有限公司)；超纯水系统(密理博-明澈-D-24UV，德国默克股份有限公司)。

1.2 试药

乙腈、甲醇(德国默克股份有限公司)；磷酸(天津市大茂化学试剂厂)；双蒸水；蒙花苷(批号：480-36-4)、木犀草苷(批号：5373-11-5)、木犀草素(批号：491-70-3)、绿原酸(批号：327-97-9)、芹菜素(批号：520-36-5)对照品均购自北京索莱宝科技有限公司，野菊花花蕾、茎、叶经湛江中心人民医院药学部鉴定为正品。

2 方法

2.1 蒙花苷含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Luna 5u C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水-冰醋酸(26∶23∶1)，检测波长为334 nm。理论塔板数按蒙花苷峰计算应不低于3 000[1]。

2.1.2 溶液制备 (1)对照品溶液制备。精密称取蒙花苷、绿原酸、木犀草素、木犀草苷、芹菜素五种对照品各1 mg，溶于4 mL甲醇，配制成0. 25 mg/mL的对照品溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过即可。

(2)供试品溶液配制。取野菊花花蕾、茎和叶粉末各0.5 g，精密称定，置于250 mL圆底烧瓶中，加甲醇100 mL，密塞，称定重量后回流提取2 h，放至室温后称重，加甲醇补足重量，摇匀， 0.22 μm微孔滤膜过滤后即可使用。

2.1.3 方法学考察 (1)线性关系考察。分别精密吸取蒙花苷对照品溶液2、6、10、14、20 μL进样测定。以蒙花苷含量(x)为横坐标，以峰面积(A)为纵坐标，计算得回归方程为A=348124x-532757，r=0.998 6。表明蒙花苷在0.25～5 mg/mL浓度范围内与其峰面积积分线性关系良好。

(2)精密度试验。精密吸取蒙花苷对照品溶液10 μL，连续进样6次，得到色谱图，计算峰面积，结果表明蒙花苷峰面积RSD为0.60%，表明仪器精密度良好。

(3)重复性试验。精密称取野菊花花蕾药材6份，按照“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，分别进样测定，得到色谱图，计算各个样品中蒙花苷的峰面积，结果表明RSD为0.91%，说明该方法重复性较好。

(4)稳定性试验。精密称取野菊花花蕾供试品溶液，分别于放置0、4、8、12、16、24 h后进样10 μL测定。结果表明蒙花苷峰面积RSD值为1.16%，说明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

(5)加样回收率。取已知蒙花苷含量的样品(蒙花苷含量为0.712%)6份，每份约0.25 g， 加入一定量的蒙花苷对照品，按照“2.1.1”项下方法操作，计算加样回收率。结果见表1。

表1 蒙花苷的加样回收率

2.1.4 含量测定 精密称取野菊花花蕾、茎、叶药材粉末0.5 g，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，测定其含量。

2.2 野菊花不同部位HPLC指纹图谱的建立

取野菊花的花蕾、茎、叶，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Luna 5u C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脱程序见表2[4]，柱温：25 ℃，流速：1.0 mL/min，进样量：10 μL。

表2 流动相梯度洗脱条件 (%)

2.2.2 检测波长确定 在200～400 nm 波长范围内扫描供试品溶液，结果表明，供试品在290、320、360 nm处有较大吸收。在360 nm处，出峰数目较多，丰度降低，各个峰的保留时间适中，分离度较好，且基线稳定，因此选择360 nm为检测波长。

2.2.3 方法学考察 (1)精密度试验。取供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件，连续进样6次，以蒙花苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD均<0.66%，相对峰面积RSD均<1.23%，表明仪器的精密度较好，符合指纹图谱测定的要求。

(2)重复性试验。取同一种供试品，制备成6份供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱方法依次进样，每次10 μL，以蒙花苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对保留面积。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD均<0.47%，相对峰面积RSD均<1.08%，表明该方法重复性较好，符合指纹图谱测定的要求。

(3)稳定性试验。取同一份供试品，分别于室温放置0、4、8、12、16、24 h 后按照上述方法测定。以蒙花苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对保留面积。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD均<0.78%，相对峰面积RSD均<1.41%，表明该供试品至少在24 h内稳定。

2.2.4 HPLC指纹图谱建立 取野菊花的花蕾、茎、叶制备的供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件测定，得到各个样品的色谱峰。

3 实验结果

3.1 野菊花不同部位蒙花苷含量

采用标准曲线法分别计算野菊花花蕾、茎、叶中所含蒙花苷含量，结果见表3。由表3数据可知，野菊花的花蕾中蒙花苷含量最高，且不同产地的花蕾中蒙花苷含量也不同。

表3 野菊花花蕾、杆、叶中蒙花苷含量 (n=3)

3.2 野菊花不同部位指纹图谱

按照“2.2.1”项下方法，分别将对照品溶液，野菊花的花蕾、茎、叶供试品溶液进样测定，结果如图1、图2所示。

4 讨论

野菊花生物活性多样、清香宜人、药源广泛、安全可靠，在药品、食品、保健品、化妆品等多领域具有开发价值，目前人们使用的野菊花药材主要以花蕾(头状花序)为主。本文测定了野菊花花蕾、茎、叶部位的蒙花苷含量，并建立了其HPLC指纹图谱，以期为野菊花药材的临床应用和资源开发提供科学依据。由本实验结果可知，不同产地的野菊花花蕾中蒙花苷含量有很大差异，且花蕾中蒙花苷含量多于茎和叶。野菊花的花蕾、茎和叶三个部位的HPLC图谱出峰个数差异较大，相同成分含量也不尽相同。由此可见，在临床用药时，宜将野菊花不同部位分开使用。

图1 对照品HPLC图谱

S1(广东佛山)；S2(广东清远)；S3(湖北宜昌)

本研究仅对一个产地的野菊花花蕾、茎和叶三个部位的蒙花苷含量和HPLC指纹图谱进行了研究，后期我们将继续研究多个产地、不同提取方法和不同采收条件下野菊花不同部位有效成分的含量及指纹图谱。