枳壳挥发油中柠檬烯含量与麸炒炮制及抑菌活性的关系

张智敏，聂 莼，李亚梅 ，彭买姣，罗 堃*，严建业,3*

(1.湖南中医药大学 药学院，湖南 长沙410208；2.湖南中医药大学 湘产大宗药材品质评价湖南省 重点实验室，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学 药学分析检测中心，湖南 长沙410208)

枳壳(AurantiiFructus)为芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培变种的干燥未成熟果实[1]，为临床最常用的理气药物之一，具有理气宽中、行滞消胀的功效。现代医学研究表明，枳壳具有调节胃肠动力、抗抑郁、抑菌等药理作用[2]。枳壳挥发油作为枳壳的主要成分，具有理气、行滞、镇咳、祛痰、抑菌等作用[3]。枳壳挥发油为单萜及其含氧衍生物[4]，其中以柠檬烯含量最高[5]，被认为是枳壳理气作用的重要成分[4]。此外，柠檬烯还具有镇咳、祛痰、抑菌等活性[6]。枳壳生品较峻烈[7]，中医认为柠檬烯具有燥性，身体虚弱者服用会伤及元气，麦麸皮能抑制枳壳酷性，令其勿伤膈，欲制其燥性，助其消导，可炒置用之[8]。本研究旨在分析麸炒炮制法对不同产地枳壳挥发油中柠檬烯含量的影响，以及枳壳挥发油的抑菌活性与其主要成分柠檬烯的关系，为枳壳挥发油的质量评价提供参考，并为深入研究枳壳药材提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 仪器

GC-2010型气相色谱仪(日本岛津有限公司)；1510型酶标仪(赛默飞世尔科技上海仪器有限公司)；LDZM-60KCS型高压蒸汽灭菌锅(上海永安医疗器械厂)；DH-400AB型电热恒温培养箱(成都致力仪器有限公司)；ZHWY-200D型恒温振荡器(上海智仁分析仪器制造有限公司)；DEN-1型麦氏比浊仪(EU for Grant Instrucments Ltd)；万分之一分析天平(美国奥豪斯)；JK-G-522B3高速万能粉碎机(上海精学科学仪器有限公司)；DZTW型调温电热套(北京市永光明医疗仪器)；挥发油提取装置(蜀牛有限公司)；SW-CJ-2FD 型净化工作台(南京迅达空气技术有限公司)。

1.2 药材与试剂

13批枳壳药材经湖南中医药大学中药鉴定教研室刘塔斯教授鉴定为芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培变种的干燥未成熟果实，来源及产地见表1。二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯、无水硫酸钠、氯化钠均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇为色谱纯；氨苄西林(编号：A100339-0005，生工生物工程(上海)股份有限公司)；硫酸庆大霉素碳酸铋(山西云鹏制药有限公司)。

表1 枳壳样品信息

1.3 菌株

金黄色葡萄球菌ATCC26003、表皮葡萄球菌、大肠杆菌ATCC44138、沙门氏菌ATCC50115均来源于广东省微生物菌种保藏中心。

1.4 培养基

营养琼脂培养基(杭州滨河生物试剂有限公司，批号：140720)；营养肉汤培养基(杭州天和微生物试剂有限公司，批号：130730)。

2 方法与结果

2.1 枳壳炮制品制备

方法参照2015年版《中国药典》。

2.2 枳壳挥发油提取

枳壳生品和枳壳炮制品粉碎过40目筛，分别取1 kg粉末样品，置于10 000 mL圆底烧瓶中，加入蒸馏水浸泡过夜，安装挥发油提取装置，参考《中国药典》2015年版第四部通则2204挥发油测定法提取枳壳挥发油，经无水Na2SO4干燥后，封装备用。

2.3 气相色谱分析

2.3.1 对照品溶液制备 精密称取柠檬烯标准品0.827 2 g，用色谱纯甲醇定容至10 mL，配制成82.72 mg/mL的柠檬烯对照品溶液。用移液枪分别精密吸取柠檬烯(浓度为82.72 mg/mL)对照品溶液0.20、0.50、1.00、1.50、2.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用色谱纯甲醇定容至刻度，摇匀，经0.22 μm滤头过滤后，备用。

2.3.2 供试品溶液制备 分别精密吸取“2.2”项下所得挥发油 200 μL，用乙酸乙酯定容至5 mL，过0.22 μm滤膜后，冷藏备用。

2.3.3 色谱条件 色谱柱：石英毛细管柱Rtx-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；样口温度：250 ℃；程序升温：50 ℃保持 5 min，然后以 10 ℃/min 升至230 ℃，保持10 min。进样量为0.8 μL，分流比为10∶1，柱压为100 kPa，载气流量为18.30 mL/min。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取“2.3.1”项下不同质量浓度梯度的对照品溶液，分别注入气相色谱仪中。以柠檬烯质量浓度(mg/mL)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。得对照品回归方程为Y=2E+06X-968 311，柠檬烯在 1.654～16.544 mg/mL浓度范围内与峰面积积分线性关系良好，R2=0.995 7。

2.3.5 精密度试验 精密吸取“2.3.2”项下同一供试品溶液(S4)，在“2.3.3” 项色谱条件下连续进样6次，测定色谱峰峰面积，各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于 3%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 精密吸取“2.3.2”项下同一供试品溶液(S4)，分别于放置0、2、4、6、8、10、12、24 h时进样，测定各主要色谱峰峰面积，各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均<2.11%，表明在24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 取S4号样品6份，按照“2.2”项下方法提取枳壳挥发油，并按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别测定色谱峰峰面积，色谱图中各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均<3%，表明方法重复性良好。

2.3.8 回收率试验 精密吸取3份S4号样品各1 mL，分别加入柠檬烯含量为4.136 mg/mL、8.272 mg/mL、12.396 mg/mL的标准品各1 mL，混匀后每个样品测定3次，得出平均回收率为96.96%，RSD为1.2%。

2.4 枳壳挥发油中柠檬烯含量测定

取供试品溶液按照“2.3.3”项下色谱条件进样分析(柠檬烯对照品和枳壳挥发油样品的气相色谱如图1所示)，记录色谱峰峰面积，采用外标法，将供试品中柠檬烯的峰面积代入“2.3.4”项下回归方程中计算其浓度，并换算成每1毫升挥发油中的柠檬烯含量。结果见表2。

A-柠檬烯对照品GC色谱；B-枳壳挥发油GC色谱(S9)；a-柠檬烯

表2 枳壳挥发油中柠檬烯含量测定结果

由表2数据可知，不同产地的枳壳挥发油中柠檬烯含量存在差异，其中湖南和江西产地枳壳的柠檬烯含量较高，而河北产地的柠檬烯含量较低。总体来说，经麸炒炮制后，枳壳挥发油中柠檬烯含量呈下降趋势。据文献[9]报道，枳壳麸炒后，其挥发油含量会降低，其中柠檬烯等低沸点组分含量有所下降，与本研究结果基本吻合。

2.5 抑菌活性检测

2.5.1 供试品溶液制备 分别精确吸取“2.2”项下挥发油样品1 mL，与40% DMSO等体积混合均匀，临用前无菌滤过，即为挥发油供试品溶液。

2.5.2 对照品溶液制备 精密称取氨苄西林标准品粉末500 mg，用无菌水定容至5 mL，得100 mg/mL的氨苄西林标准储备液。精密吸取储备液200 μL，用无菌水稀释至100 mL，得到200 μg/mL氨苄西林阳性对照品溶液。精密称取每0.6 g含40 mg庆大霉素的硫酸庆大霉素碳酸铋0.3 g，用无菌水稀释至100 mL，得到200 μg/mL庆大霉素阳性对照品溶液。

2.5.3 菌悬液配制 分别将实验用菌种接种于营养琼脂平板上，37 ℃恒温培养24 h后，挑选特征菌落接种于营养肉汤培养基中，37 ℃摇床培养12 h后，采用麦氏比浊法用无菌生理盐水将其稀释至0.5麦氏比浊单位，即1.5×108CFU/mL菌悬液，备用。

2.5.4 最低抑菌浓度(MIC)测定 在无菌的96孔板A-H排每孔中各加入100 μL营养肉汤，分别吸取四种预先配制的挥发油供试品溶液各100 μL至A排1-3/4-6/7-9/10-12孔(即每块96孔板做一种菌的4个不同供试品，每个供试品重复操作3次)，混合均匀；从A排每孔分别吸取100 μL溶液至B排相应孔，依次倍比稀释(吸取前注意混合均匀)，H排各孔弃去100 μL溶液。同时设置氨苄西林阳性对照和庆大霉素阳性对照(以倍比稀释的抗生素替代药液)、无菌水阴性对照、40% DMSO阴性对照、挥发油供试品溶液空白对照(以无菌水替代菌液)、培养基空白对照(以无菌水替代药液及菌液)。最后于每孔中各加入100 μL菌悬液(1.5×108CFU/mL)，在37 ℃下培养24 h后观察，并于600 nm处测定吸光值A。目测抑菌液浓度最低且澄清的孔(即(A供试品-A供试品空白对照)/A培养基空白≈1)所对应的即为最小抑菌浓度(MIC)。结果见表3。

表3 枳壳挥发油MIC测定结果 (μL/mL)

由表3可以看出，枳壳挥发油对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)的抑菌效果要强于革兰氏阴性菌(大肠杆菌和沙门氏菌)，这是由于革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的细胞壁结构不同：革兰氏阴性菌的细胞壁有一个额外的外膜组成的双层脂多糖[10]，脂多糖分子通过排斥挥发油的疏水性成分形成屏障，阻止挥发油进入细胞壁内[11]。而革兰氏阳性菌的细胞壁只有一层,主要由肽聚糖组成，由于缺少这种屏障，挥发油中的疏水性成分更易渗透，一些成分与细胞壁上的特定靶点结合，从而破坏细胞膜，使细胞质流出，最终导致细菌死亡[12]。但是S4、S8、S13、S17枳壳挥发油出现对沙门氏菌的抑菌活性强于金黄色葡萄球菌的现象，这可能是由于细菌上的不同细胞靶点以多种形式结合挥发油的不同成分，从而使沙门氏菌对枳壳挥发油比革兰氏阳性菌更加敏感[13]。

此外，由表3可知，枳壳经麸炒炮制后，其挥发油的抑菌活性有所增强，该结果与文献[14]报道的结论一致。

2.6 柠檬烯含量与抑菌活性关联分析

采用SPSS17.0中双变量相关分析方法，以枳壳挥发油中柠檬烯含量作为X变量，1/MIC值作为Y变量，计算两者的Pearson相关系数。结果见表4。

表4 柠檬烯含量与抑菌活性的Pearson相关性

注：X：枳壳挥发油中柠檬烯含量；Y1：大肠杆菌的1/MIC值；Y2：沙门氏菌的1/MIC值；Y3：金黄色葡萄球菌的1/MIC值；Y4：表皮葡萄球菌的1/MIC值。

由表4可知，枳壳挥发油中柠檬烯含量与其对表皮葡萄球菌和沙门氏菌的1/MIC呈负相关，说明枳壳挥发油中柠檬烯所占比例越小，其挥发油对表皮葡萄球菌和沙门氏菌的抑制作用越强；枳壳挥发油中柠檬烯含量与其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的1/MIC呈正相关，说明枳壳挥发油中柠檬烯所占比例越大，其挥发油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用越强。

3 讨论

本研究探讨了麸炒炮制对枳壳挥发油中柠檬烯含量的影响，并初步分析了枳壳挥发油的抑菌活性与柠檬烯含量的关系，发现麸炒会降低枳壳柠檬烯含量。此外，枳壳挥发油中柠檬烯含量越高，其挥发油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用越强。然而，植物挥发油的抑菌效果可能是其挥发油中多种成分协同作用的结果[15]。因此，分析枳壳挥发油中其他低含量成分对枳壳挥发油抑菌活性的影响，针对枳壳挥发油抑菌活性进行全面的谱效分析以及开展验证实验将是下一步的研究方向。